摘要 [目的]获得转双基因的植株，研究植物逆境诱导基因ABP9和ZmCBF3的协同表达对玉米抗逆性的影响。[方法]通过农杆菌侵染的方法将ABP9和ZmCBF3基因同时转入玉米中，并对T0代植株进行分子鉴定。使用含有ABP9启动子驱动ABP9和ZmCBF3双基因载体的农杆菌侵染玉米幼穗，获得T0代种子；在田间通过对玉米苗喷洒草铵膦除草剂筛选获得具有草铵膦抗性的玉米植株。[结果]挑选10株抗性玉米苗小量提取DNA并进行PCR扩增分析，其中5个植株出现特异条带；大量提取PCR阳性玉米的DNA进行Southern杂交分析，9TQ5号植株在与bar探针和ABP9探针杂交时均出现特异条带。[结论]9TQ5号植株为转基因阳性植株，为后续试验提供了材料。
关键词 分子鉴定；转基因；ABP9；ZmCBF3
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03160-02
Abstract [Objective] In order to study the coordinated expression of plant stress induced gene ABP9 and ZmCBF3 effect on the resistance of maize， transgenic plants are desired. [Method] In this study， ABP9 and ZmCBF3 genes were introduced into maize through Agrobacterium tumefaciensmediated transformation， and transgenic plants at T0 generation were identified at molecular levels. We used the Agrobacterium stain containing an expression vector in which ABP9 and ZmCBF3 were driven by ABP9 promoter to infect the young ear of maize， and harvested T0 generation seeds. T0 plants tolerant to glufosinate were obtained by leafspray in the field. [Result] 10 glufosinate tolerant plants were selected and 5 of them were identified positive by PCR. Southern hybridization with bar and ABP9 probes showed that 9TQ5 had specific bands. [Conclusion] These results identified 9TQ5 as the transgenic plant， which will be used in further research.
Key words Molecular identification； Transgenic； ABP9； ZmCBF3
玉米是当今中国最重要的粮食作物，其种植面积最广，总产量最多，但在生产过程中，仍然面临着许多严峻的问题[1]。玉米以其强的环境适应能力而获得了非常广的种植，然而其中大部分地区属于干旱或半干旱环境[2]。干旱抑制植物的正常生长，使植物光合效率下降，这对玉米的高产稳产造成了严重的不良影响[3]，如2012年干旱和高温造成淄博市玉米的大幅减产[4]。植物受到旱胁迫后，细胞膜上的“渗透感受器”能感知渗透压的变化并激发细胞内的第2信使系统[5]，进而诱导抗旱相关基因的表达，其信号转导途径包括ABA依赖型和ABA非依赖型[6]。依赖ABA信号转导通路中的基因表达主要通过bZIP和MYB/MYC 2类转录因子与其相应的顺式作用元件结合来介导[7]。目前已克隆得到的这类基因多达几百个[8]，如拟南芥中的RD29B基因和RD22基因[7]，水稻中的OsMYB3R2基因[9]。
玉米过氧化氢酶基因Cat1是受ABA诱导的逆境响应基因[10]。实验室已经通过酵母单杂交技术，使用玉米Cat1基因启动子区的顺式作用元件ABRE2筛选玉米幼胚cDNA文库，分离得到玉米ABP9基因，并证明ABP9蛋白作为bZIP类转录因子参与了依赖ABA的逆境信号转导途径[11]。ABP9基因在转基因拟南芥中表达能够显著增强植株对于干旱、高盐、低温和氧化胁迫等多种逆境的抗性；同时，转基因拟南芥在种子萌发、根系生长和气孔开闭方面对外源ABA也表现出敏感性，能够提高植株自身的节水能力[12-13]。在黑麦草中已证明ABP9基因提高了转基因植株的抗逆性[14]；在大豆中的研究也取得了一定的进展[15]。这些都说明，ABP9基因在提高植物对非生物逆境的耐受性方面发挥着至关重要的作用。
ZmCBF3转录因子是与拟南芥中受低温逆境诱导表达的COR15a基因启动子区C重复基序相结合的反式作用因子。前期研究表明，ZmCBF3参与玉米对逆境的响应，受ABA和低温诱导上调表达，并且在胚发育过程中非常活跃[16]。ZmCBF3过表达的转基因水稻，在正常生长状况下并没有表现出生产阻滞，与野生型水稻产量相当；但是，在干旱、高盐和低温等逆境胁迫下，转基因水稻表现出高存活率、低丙二醛含量和相对低的电导率。这说明，ZmCBF3增加了水稻中逆境诱导基因的表达，增强了植株对于干旱、高盐和低温的耐受力[17]。笔者将ABP9基因和ZmCBF3基因构建在同一双元表达载体上并转化玉米，并对转基因T0代植株进行分子鉴定，以期为研究2个逆境诱导基因协同表达对抗逆性的影响以探索新的转基因抗逆育种策略提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 试验所用玉米为山东省农业科学院玉米研究所选育的齐319自交系，种植于中国农科院廊坊基地。农杆菌C58C1菌株由实验室保存，其中含有的pCAMBIA3301Pabp9ABP9Pabp9ZmCBF3质粒由实验室构建（图1）。试验所用引物合成自生工公司，PCR扩增相关试剂购自宝生物公司，杂交用尼龙膜Amersham HybondN+购自GE公司，同位素购自同辐公司，探针合成试剂盒购自promega公司，内切酶购自NEB公司，DNA回收试剂盒购自天根公司，Tris、SDS、CTAB购自sigma公司，草铵膦购自永农公司，其他试剂均为国产分析纯，市售。
1.2 农杆菌介导的玉米转化 以拟南芥花序浸染的方法为基础，参照小麦和黑麦中对浸染方法的改良[18-19]，转化玉米。由于玉米的雌穗被包叶包裹，所以试验将农杆菌液注射到包叶与雌穗之间，达到浸染的目的，从而转化玉米。
1.3 田间筛选 pCAMBIA3301载体含有标记基因bar，可提供草铵膦抗性，用于田间大规模筛选。实验采用方法为：当玉米生长至四叶期时，均匀喷洒浓度为0.03%的草铵膦溶液，保证每片叶子都均匀覆盖。根据以往经验，1～2周即可观察到明显的结果。需要注意的问题是，喷洒草铵膦后6 h左右才能被叶片完全吸收，所以喷洒后6 h内不能喷灌浇水或遭受降雨。
1.4 PCR扩增筛选 小量提取田间除草剂筛选后具有抗性的玉米植株的DNA[20]，作为PCR扩增模板，分别扩增标记基因bar和目的基因之一的ABP9的特异片段，再通过1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。所用引物序列为：
bar：Fw：5’TCAAATCTCGGTGACGGGC3’，Rv：5’ACGCACAATCCCACTATCCTTC3’；
ABP9：Fw：5’CGAAGAAAAAGAAGCTGGTGGAG3’，Rv：5’TGCGGGACTCTAATCATAAAAA CC3’。
扩增片段长度分别为672和559 bp（图1）。将20 μl反应体系95 ℃变性5 min后，按94 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s进行35个循环的反应，最后72 ℃再延伸10 min。
1.5 Southern杂交分析 大量提取PCR扩增阳性玉米植株的DNA[20]，取20 μg分别经限制性内切酶Dra I和Hind III消化，经过0.7%的琼脂糖凝胶电泳分离，向上毛细管法转移至带正电的尼龙膜上。Dra I消化的DNA使用bar基因探针杂交；Hind III消化的DNA使用ABP9基因探针杂交。探针为“1.4”中所述引物PCR扩增质粒所获DNA片段（图1），电泳回收后测序结果正确，使用α32PdCTP通过随机引物法标记。
2.3 Southern杂交结果 对筛选出的PCR阳性植株进行Southern杂交分析。经过Dra I消化后的DNA使用bar基因的片段作为探针进行杂交（图4a），5号样品出现3条特异条带，野生型无特异条带。因此，这3条带均为目的条带。经过Hind III消化后的DNA使用ABP9基因的片段作为探针进行杂交（图4b），5号样品出现5条杂交条带，野生型齐319出现3条杂交条带。因此，5号样品有2条特异条带，为转入的目的基因。Southern杂交结果说明，9TQ5号植株为转基因植株。
3 结论与讨论
干旱在所有非生物逆境中，对作物的威胁最大。试验将同为逆境诱导的ABP9和ZmCBF3基因共转化玉米，并通过
玉米功能基因组研究需要创制大量的转基因材料。但由于玉米自交系的遗传转化效率非常低且重复性差，并且基因组相对巨大且复杂，导致在转基因植株的分子鉴定中，假阳性、假阴性的出现非常频繁，因此需要综合运用多种手段鉴定转基因植株。试验采用除草剂喷施、PCR扩增、Southern杂交等方法，对外源插入片段中的不同基因分别进行分子鉴定，并将结果综合起来判断，提高了筛选的准确性。运用这些方法应该注意的问题有：不同的玉米自交系对于除草剂的耐受性不同，需摸索确定所用转基因受体自交系的除草剂敏感浓度；PCR鉴定中，重复性不好的植株应该果断排除；复杂基因组Southern杂交的优化需要在具体试验时不断摸索。
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