摘要：为了研究鸡α干扰素（ChIFNα）基因的特性和功能，将鸡α干扰素的DNA序列克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）分泌表达载体pPIC9K中，并转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株，用PCR技术鉴定阳性转化子。重组菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇诱导后，分泌表达重组蛋白，斑点杂交（dot-blot）检测IFNα具有免疫原性。细胞病变抑制法表明，表达产物有明显的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒活性。
关键词：鸡α干扰素；巴斯德毕赤酵母；免疫原性；细胞病变抑制法
中图分类号： S852.65+7文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0049-03
收稿日期：2013-12-24
作者简介：韦琴（1981—），女，湖北天门人，硕士，讲师，主要从事生物化学与分子生物学方向的研究。E-mail：53471348@qq.com。干扰素（interferon，IFN）是一类具有广谱抗病毒活性的细胞因子，能调节机体免疫反应[1]。α干扰素是由能在脊椎动物各种类型的细胞中增殖的病毒诱导白细胞产生的[2]，其主要活性是抗病毒。Sekellick等于1994年克隆表达了鸡的α干扰素 （ChIFNα）基因[3]，其后的文献也报道了红色原鸡中命名为IFNA1、IFNA2和IFNA3的干扰素基因序列[4-5]。到目前为止，已知ChIFNα的抗病毒能力较强，比ChIFNβ强20倍左右。对于巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的研究起始于1970年左右。巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源，大量合成外源蛋白质的酵母菌，因此，该酵母引起了人们的兴趣和关注，得到了广泛的研究和应用。目前有关细胞因子在巴斯德毕赤酵母中获得表达的报道屡见不鲜[6-9]。
我国养禽业经过近30年的持续稳步增长，已成为世界上最大的养禽国之一。禽病大规模暴发会给我国养禽业带来巨大的经济损失，因此，利用干扰素基因结合基因工程手段生产生物制剂，来预防和治疗禽类的各种病毒传染病具有重要意义。本研究以质粒pPIC9K为骨架，成功构建了巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K-IFNα，在巴斯德毕赤酵母菌GS115中获得了分泌表达的重组干扰素，并进一步探讨了其抗病毒活性。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1质粒和菌株pET28a-IFNα质粒：大小约489 bp的去信号肽ChIFNα基因序列，由华中农业大学微生物国家重点实验室构建[10]。酵母表达载体及酵母受体菌GS115购自Invitrogen公司。
1.1.2试剂和培养基常用工具酶、DNA marker均购自TaKaRa公司；酵母氨基（yeast nitrogen base withour amino acids，YNB）、生物素购自Pifco公司。
1.1.3血清和酶标抗体辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG二抗购自华美公司；兔抗鸡α干扰素多抗由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室制备和提供。
1.1.4鸡胚和病毒鸡H9N2亚型禽流感病毒由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室提供，SPF（specific pathogen free）鸡胚购自北京梅里亚维通实验中心。
1.2重组质粒pPIC9K-IFNα的构建
pET28a-IFNα经EcoRⅠ与NotⅠ双酶切，用T4 DNA连接酶将回收产物IFNα基因片断与经相同酶切的pPIC9K质粒连接，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，平板涂布后挑取单菌落。提取的重组质粒pPIC9K-IFNα由酶切鉴定。
1.3重组质粒pPIC9K-IFNα的转化及鉴定
1.3.1pPIC9K-IFNα的转化将提纯的pPIC9K-IFNα质粒用SalⅠ酶切线性化，电泳回收后置于-20 ℃备用。用 0.1 mol/L 的LiCl制备GS115酵母感受态。将线性化的表达质粒在LiCl、50% PEG与2 mg/mL ssDNA的辅助下转化至GS115酵母感受态细胞中，涂布于MD（minimal dextrose）固体平皿上，置28 ℃温箱培养3～4 d。
1.5重组鸡α干扰素抗病毒活性的初步检测
用细胞病变抑制法探讨重组干扰素抗病毒的能力[12-16]：鸡胚成纤维细胞于96孔灭菌细胞培养板中，饱和二氧化碳水汽培养箱37 ℃培养，长成单层。每列各100 μL/孔加入10倍系列稀释的干扰素表达产物，同时设细胞空白对照（只加维持液，不加病毒和干扰素）和病毒对照（只加病毒，不加干扰素）；1 d后，每孔加入稀释的H9N2禽流感病毒（100倍TCID50溶液浓度）。1 d后，开始观察细胞病变。
2结果与分析
2.1重组质粒pPIC9K-IFNα的构建
回收产物IFNα基因片段与pPIC9K载体连接后，转化DH5α，挑白色菌落，小量提取重组质粒，用EcoRⅠ和NotⅠ双酶消化，得到500 bp的小片段和9 kb的大片段，2个条带与预期结果一致（图1）。表明目的片段已成功克隆到载体中，命名为pPIC9K-IFNα。
2.2重组酵母染色体阳性克隆子pPIC9K-IFNα的PCR鉴定
随机挑取在MD平皿中的GS115/pPIC9K-IFNα酵母单菌落，经酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养至对数生长期，提取酵母DNA作为模板进行PCR检测。分别以2对引物作2组PCR鉴定（图2）。结果表明，2对引物均扩增出1条特异性很高的目的片段，长度分别是500 bp和695 bp，与预期片段大小相符，表明重组质粒pPIC9K-IFNα已成功整合到GS115 菌株染色体中。
2.3重组酵母菌的表达和dot-blot分析
经dot-blot分析确证，重组酵母菌诱导表达的上清液检测出颜色较深的斑点，而空白菌没有（图3）。结果表明，GS115/pPIC9KIFNα表达产物具有良好的免疫原性。
2.4重组鸡α干扰素表达产物抗病毒活性初步检测
在鸡胚成纤维细胞上分析重组干扰素表达产物抗病毒的能力。结果显示，空白对照孔细胞生长良好，阳性对照孔细胞皱褶，病变严重（90%病变）；加入102、103、104倍稀释后的表达产物的细胞孔中细胞生长状态与空白对照孔一致，基本无病变；表达产物105倍稀释后，所加的细胞孔中细胞生长状态仍然良好，有15%的病变，表明105倍稀释后的干扰素依然有抗病毒的活性；106倍稀释后所加的细胞孔中细胞有40%病变，107、108倍稀释后所加的细胞孔中细胞发生90%的病变（图4）。以上结果表明重组鸡α干扰素能够抑制H9N2禽流感病毒的复制。
3讨论与结论
巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的具有高效分泌表达的一种真核表达系统，该系统能进行真核转录后修饰，如糖基化、二硫键的形成和蛋白水解处理，在表达产物的加工、外分泌等方面优势明显[17]。本研究选用的载体pPIC9K是一种分泌表达载体，不仅能够实现翻译后糖基化修饰和正确折叠，而且有利于表达产物的纯化。
在本试验中，重组菌GS115/pPIC9K-IFNα的诱导上清经dot-blot分析，发现其能分泌表达出IFNα，证实重组蛋白IFNα分泌到巴斯德毕赤酵母细胞外，且有一定的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒的活性。本试验为重组鸡干扰素作为疫苗佐剂的研究和推广应用打下基础。
参考文献：
[1]Janeway C A，Traver P，Walport M，et al. Immunobiology[M]. New York：Garland Publishing，2004：81-90.
[2]陆承平. 兽医微生物学[M]. 3版. 北京：中国农业出版社，2001：452.
[3]Sekellick M J，Ferrandino A F，Hopkins D A，et al. Chicken interferon gene：cloning，expression，and analysis[J]. Journal of Interferon Research，1994，14（2）：71-79.
[4]Ben-Nun A，Mendel I，Bakimer R，et al. The autoimmune reactivity to myelin oligodendrocyte glycoprotein （MOG） in multiple sclerosis is potentially pathogenic：effect of copolymer 1 on MOGinduced disease[J]. Journal of Neurology，1996，243（1）：14-22.
[5]Hohlfeld R. Biotechnological agents for the immunotherapy of multiple sclerosis：Principles，problems and perspectives[J]. Brain：a Journal of Neurology，1997，120（Pt 5）：865-916.
[6]Fairlie W D，Zhang H，Brown P K，et al. Expression of a TGF-beta superfamily protein，macrophage inhibitory cytokine-1，in the yeast Pichia pastoris[J]. Gene，2000，254（1/2）：67-76.
[7]Clare J J，Romanos M A，Rayment F B，et al. Production of mouse epidermal growth factor in yeast：high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies[J]. Gene，1991，105（2）：205-212.
[8]Hollenberg C P，Gellissen G. Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts[J]. Curr Opin Biotech，1997，8：554-560.
[9]严琳，陈焕春，覃雅丽，等. 猪白细胞介素-2在甲醇酵母中的表达[J]. 畜牧兽医学报，2004，35（2）：208-212.
[10]韦琴，彭贵青，金梅林，等. 鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究[J]. 生物工程学报，2006，22（5）：737-743.
[11]刘秋云，罗樨，何康泽，等. 快速制备酵母质粒和基因组DNA PCR模板[J]. 微生物学通报，2001，28（5）：77-79，84.
[12]孙为民，王惠琴. 细胞因子研究方法学[M]. 北京：人民卫生出版社，1999：433-458.
[13]Rubinstein S，Familletti P C，Pestka S. Convenient assay for interferons[J]. Journal of Virology，1981，37（2）：755-758.
[14]Armstrong J A. Semi-micro，dye-binding assay for rabbit interferon[J]. Applied Microbiology，1971，21（4）：723-725.
[15]Green J A，Stanton G J，Goode J，et al. Vesicular stomatitis virus plaque production in monolayer cultures with liquid overlay medium：description and adaptation to a one-day，human interferon-plaque[J]. Journal of Clinical Microbiology，1976，4（6）：479-485.
[16]费峥峥，关怡新，姚善泾. 重组人γ干扰素复性过程中体外活性检测方法研究[J]. 微生物学通报，2004，31（3）：65-69.
[17]Cereghino J L，Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiology Reviews，2000，24（1）：45-66.