目的：探究RNA干扰技术的原理与应用。方法：选择Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色谱柱，直径分别为4.6×300mm、2.1×30mm，流速分别为≤0.35mL/min、0.05～0.075mL/min，柱温分别为<60℃、20℃～25℃，pH范围分别为2～12、2.5～7.5，流量参数分别0.3mL/min、0.075mL/min，分子退出系数为170 200，样品总体积500μl，盐酸小檗碱浓度10、15、20、30、40pmol/μL；给予HPLC级乙腈、HPLC梯度级水以及P4417SIGMA磷酸盐缓冲盐水（0.01M），检测波长260nm，经由体积排阻色谱法分析检测。结果：不同浓度下，浓度与峰高之间呈正比关系，R2=0.9302，方程y=5.069x-14.172。结论：采用不同色谱柱及盐酸小檗碱用于评估RNA干扰技术的应用效果较好。
RNA技术在制药产业应用范围较广泛，比如乳腺癌、脑部胶质瘤等恶性肿瘤、以及遗传性疾病等。由于制药涉及的原理及机制比较复杂，类型较多，比如反义寡核苷酸、小干扰RNA等，但由于RNA药物修饰、传递及免疫激活等方面尚未完全研究清楚，因此需进一步研究[1-2]。盐酸小檗碱是一种生物碱，具有抑菌作用，能够有效清除毒素，作为寡核苷酸修饰后产物，属于临床常用药，可单用，也可作为添加于其他药物，作为一种药物成分[3-4]。本次研究选择Dionex Ultimate3000型色谱仪，分别选择Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色谱柱，经由体积排阻色谱法进行检测，分析检测结果，获得一定研究成果，现报告如下。
资料与方法
设备与试剂
本次研究选择Dionex Ultimate3000（Thermo Scientific制造）型色谱仪，分别选择Acclaim SEC-300（5μm，分析范围4.6×300mm，由Thermo Scientific制造）及MAbPac SEC-1色谱柱（5μm，分析范围2.1×300mm，由Thermo Scientific制造），浓度测量仪器为Nanodrop2000（Thermo Scientific制造），离心机为Thermo Legend Micro17离心机，20μL环形Nano Viper/彩色PEEK管（内部直径为0.18mm），震荡搅拌机，Mettler toledo 320 pH计；主要化学试剂如下：HPLC梯度级水（Fisher Scientific制造，英国），HPLC级乙腈（Fisher Scientific制造，英国），P4417 SIGMA磷酸盐缓冲盐水（片剂，一片溶于200mlHPLC水中，得到0.01M磷酸盐缓冲液）；盐酸小檗碱（产品编号GZDD-0060，CAS号633-65-8，质地纯度≥98.837%，来自贵州迪大科技有限责任公司，常规包装30mg）。
方法
本次研究选择Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色谱柱，其直径分别为4.6×300mm、2.1×30mm，流速分别为≤0.35mL/min、0.05～0.075mL/min，柱温分别为<60℃、20℃～25℃，pH范围分别为2～12、2.5～7.5，流量参数分别0.3mL/min、0.075mL/min，平衡时间分别为50min、42min；给予HPLC级乙腈、HPLC梯度级水以及P4417SIGMA磷酸盐缓冲盐水（0.01M），检测波长260nm，经由体积排阻色谱法进行检测，分析检测结果。检测方法如下：1）吸取HPLC梯度级水（5μL）转移至设备顶部，合上装置臂，再次打开后，擦拭顶部HPLC梯度级水，重复2～5次，保证设备顶部足够干净；2）进入系统设置后，选择计算机系统中的寡核苷酸计算模式，输入序列后，得到分子量及分子退出系数等实验基础参数；3）盐酸小檗碱检测样品浓度10、15、20、30、40pmol/μL；测试盐酸小檗碱样品前，以2μL HPLC梯度水作为实验的空白对照组，开始样品浓度测试，每次吸取样品2μL；实验结束后，仪器顶部同样使用HPLC梯度级水清洗；准备好样品（单个样品总体积500μl，最大浓度400pmol/μl）、制备缓冲液，设定浓度为5pmol/μl；-20℃条件下保存于冰冻箱内；检测时，将样本取出后放置于室温下，直至样品完全融化后，经涡旋混合器混合、经离心5min后，去除气泡，再继续其余实验步骤；层析寡核苷酸样品，自动取样针依次吸取PBS缓冲液、盐酸小檗碱样品、PBS缓冲液；每个缓冲液均需在脱气15min后再与色谱系统相连，在实验中持续关注PBS缓冲液情况，PBS缓冲液需及时更换，但不得中断，保证色谱柱不干燥[5-7]。
结果
盐酸小檗碱在40.371～215.109pmol/μL浓度范围内与峰高之间存在线性关系，R2=0.9302，方程y=5.069x-14.172，详见表1-表5。
结论
20世纪初，国外学者初次提出dsRNA能够对mRNA产生具有特异性作用的讲解作用，能够特异性抑制相应基因在生物体内的表达，也就是在转录后出现基因沉默现象，即RNA干扰，广泛存在于生物体内，属于机体排除外源性核酸物质及内源性异常表达物质所表现出的生物自我保护机制，这为临床研究基因药物提供具有临床效果良好的研发思路。随着对RNA干扰技术的不断深入研究，以及应用RNA干扰技术研发药物应用率逐渐提升，该技术有望成为研究基因药物的重要工具，从而为肿瘤及遗传性疾病的治疗提供强烈助力。小干扰RNA，即siRNA，通常需要与碱基配对后，方可对同源的mRNA进行有效识别，并参与其介导过程。据文献报道，siRNA在生物体内具有一种结构相似的双联RNA，而且siRNA形成过程中，核酸酶Dicer以二聚体形式参与该过程，由于不同生物体内的核酸酶Dicer存在一定的差异，因此形成的siRNA结构也存在一定的差异，由此引发的干扰复合体，即RISC，其把序列作用是反义siRNA，在ATP存在条件下，双链siRNA被解开，即正义链与反义链互换，而且在RISC活化状态下靶mRNA序列被切断。然后新siRNA与同源的新mRNA进行有效识别配对。siRNA相关药物样品可在单修饰及完全修饰情况下，在不同条件下进行影响的检测及研究，有助于从不同方面进一步研究该药物的功效及药理作用。本次研究所用的药物属于植物体内合成后提取，化学性质比较稳定，为检测提供良好的物质基础。
参考文献
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（作者简介：刘敏楠，谢菲尔德大学（英国），研究方向为生物工程。）