[摘要] 目的 研究核苷（酸）類似物（Nas）治疗停药后复发的慢性乙肝患者HBV逆转录酶区耐药突变情况。 方法 收集2014年1月～2016年1月在徐州市中心医院就诊的慢性乙肝患者110例，患者既往服用Nas时间6个月以上，因各种原因停药后病情复发。用PCR-反向点杂交法检测HBV耐药突变位点及基因型。 结果 在110例血清标本中有耐药突变位点产生的62例，检出率是56.36%，其中rtL180M，rtM204V，rtM204I，rtA181V检出率较高，检出例数（检出率）分别是36例（32.73%）、24例（21.82%）、24例（21.82%）、14 例（12.73%）；在110例患者中对Nas耐药的有58例（52.73%），主要耐药突变模式是rtL180M+M204I/V、rtM204I和rtA181V。患者对拉米夫定（LMV）、替比夫定（LDT）、阿德福韦酯（ADV）耐药比例分别是52.73%，22.73%，14.55%；有43例患者存在恩替卡韦（ETV）耐药风险（39.09%）。24例患者对LMV和LDT耐药，比例是21.82 %；14例（12.73%）对LMV和ADV耐药；2例（1.82%）对LMV、LDT、ADV耐药。HBV RT区发生耐药突变与患者的年龄、性别、基因型无关（P > 0.05）。 结论 Nas治疗慢性乙肝停药复发患者的耐药突变发生率较高；停药复发患者有必要检测HBV耐药突变，为继续治疗提供重要依据。
[关键词] 慢性乙肝；乙肝病毒；停药；复发；耐药；突变
[中图分类号] R512.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（b）-0107-04
[Abstract] Objective To investigate the mutation of hepatitis B viurs DNA reverse transcriptase in chronic hepatitis B patients with relapse after nucleot（s）ide analogues withdrawal. Methods From January 2014 to January 2016， in Xuzhou Central Hospital， 110 serum samples of patients with chronic hepatitis B were collected. Patients took nucleoside （acid） drugs for more than 6 months； due to various reasons， patients after withdrawal of the disease recurrence. HBV resistance mutation sites and genotypes were detected by PCR- reverse dot blot hybridization. Results There were 62 drug resistant mutations， the detection rate was 56.36%； including 36 cases of rtL180M （32.73%）， 24 cases of rtM204I （21.82%）， 24 cases of rtM204V （21.82%）， 14 cases of rtA181V （12.73%）； the number of patients with drug resistance was 58 cases （52.73%）， and the main patterns of mutation were L180M+M204I/V， M204I， A181V. Drug resistance rates of Lamivudine （LMV）， telbivudine （LDT）， adefovir dipivoxil （ADV） was 52.73%， 22.73%， 14.55% respectively； there were 43 patients with entecavir resistance risk （39.09%） among them. 24 patients were resistant to LMV and LDT， the ratio was 21.82%； 14 patients were resistant to LMV and ADV， the ratio was 12.73%； 2 patients were resistant to LMV， LDT， ADV， the ratio was 1.82%. Mutations in the HBV RT region were independent of age， sex， genotype （P > 0.05）. Conclusion The incidence of drug resistance mutation in chronic hepatitis B patients with relapse after withdrawal was higher； it is necessary to detect the mutations in chronic hepatitis B patients with relapse after withdrawal， so as to provide basis for clinical treatment.
[Key words] Chronic hepatitis B； Hepatitis B viurs； Withdrawal； Relapse； Drug resistant； Mutation
核苷（酸）类似物[nucleot（s）ide analogues，NAs]在临床上广泛用于慢性乙肝（CHB）的抗病毒治疗，该类药物通过直接靶向抑制HBV逆转录酶（RT）的活性来发挥抗病毒的作用，但对HBV复制的原始模板共价闭合环状DNA（cccDNA）没有直接抑制作用，所以需要长期用药。然而CHB患者长期治疗费用高，依从性差等原因，会造成不规范停药；由于核苷（酸）类似物不能直接清除cccDNA，因此停药后，部分患者体内HBV可重新启动复制，造成肝炎复发，需要继续用药治疗[1]。但是由于HBV的复制极其活跃及其RT又缺乏校正功能，所以HBV变异率比其他DNA病毒相对高数倍，因而具有高度变异的特性[2]。所以在NAs治疗HBV过程中，HBV 易发生耐药突变，是治疗失败的主要原因[3]。因此有必要研究核苷（酸）类似物治疗慢性乙肝停药复发患者的HBV耐药突变情况，本研究对此类患者進行了HBV 耐药突变检测，为临床治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2014年1月～2016年1月徐州市中心医院就诊的CHB患者的血清标本110 例，其中男91例，女19例，年龄21～67岁，平均（40.3±11.8）岁。所有患者均经核苷（酸）类似物治疗后，因各种原因停药后病情复发，患者血清HBV DNA定量标准>1×103 copies/mL的阳性标本；CHB的诊断和复发标准均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[4]；排除其他肝炎疾病如HCV、HDV、HIV等混合感染。
1.2 试剂、仪器及检测方法
HBV耐药突变检测试剂盒和HBV DNA提取试剂盒购自亚能生物技术（深圳）有限公司。仪器有深圳亚能分子杂交仪（YN-H16），上海宏石SLAN-96S全自PCR仪。使用 PCR-反向点杂交法检测 HBV耐药突变位点与基因型[2]，该法检测HBV耐药突变位点（rt180、rt204、rt207、rt181、rt236）和基因型（B、C、D）。
1.3 方法
1.3.1 标本采集和处理 采集患者静脉血 3 mL，注入真空采血管，室温静置30～60 min，然后 2000 r/min离心10 min。如果不能当天及时检测，吸取上层血清转移至无菌离心管中，保存于2～8℃不超过48 h、-20℃下不超过半年完成实验。
1.3.2 HBV DNA 的提取 在1.5 mL离心管中加入200 μL HBV DNA 提取液I及待测血清，13 000 r/min离心5 min。吸弃上清液，加入50 μL HBV DNA提取液Ⅱ，震荡混匀至沉淀完全溶解，沸水浴10 min。加入5 μL三氯甲烷，混匀，13 000 r/min离心5 min。取上清1.5 μL作为PCR反应模板。阴、阳性制品与血清标本的处理方式相同，同步处理。
1.3.3 PCR扩增 取1.5 μL样品DNA加入反应液管，同时做阴阳性质控品。扩增条件：50℃ 2 min；95℃ 10 min；94℃ 60 s，68℃ 90 s，30 Cycles；94℃ 30 s，54℃ 30s，72℃ 30s，30 Cycles；72 ℃ 5 min 。以1.4℃/s 的速度设置升降温。
1.3.4 杂交、洗膜及显色 PCR扩增产物与A液杂交1.5 h。由B液、C液洗膜，最后在显色液中显色，观察结果。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
在110 例CHB患者中检出HBV C型101例（91.82%），B型5例（4.55%），BC型2例（1.82），BD型1例（0.91%），D型未检出，其中有1例检出野生型位点，但未检出基因型。在C型的标本中检出耐药突变位点58例，其中有4例仅检出耐药突变位点rtLl80M；在B型的标本中检出耐药突变位点3例，BC型有1例。在HBV逆转录酶区（RT区）耐药突变位点分别检出rtLl80M，rtM204V，rtM204I，rtAl81V，rtN236T，rtM207I，检出例数分别是36例、24例、24例、14例、3例、2例，检出率分别是32.73 %、21.82%、21.82%、12.73 %、2.72 %、1.82 %。
58例耐药标本HBV RT区耐药突变模式与对应的核苷（酸）类似物耐药情况，详见表1。
将患者的年龄、性别、基因型作为耐药突变相关因素进行分析，HBV RT区发生耐药突变与患者的年龄、性别、基因型无关（P > 0.05）。见表2。
3 讨论
HBV基因组P区编码多种功能蛋白，包括DNA聚合酶[5]。此酶既有以RNA为模板合成DNA的逆转录酶功能，又有催化合成DNA的多聚酶功能。目前，NAs均以HBV逆转录酶作为靶点，发挥抑制病毒复制的作用。有研究结果显示，即使严格按照指南推荐的停药标准，仍有44.0%～61.4%的患者在1年内复发[6-7]。由于HBV易发生基因耐药突变，病情复发的CHB患者若继续治疗，会有耐药风险，导致治疗失败[8]。
本研究检测HBV RT区耐药突变，分析核苷（酸）类似物耐药情况。结果显示，发生率较高的突变位点是rtLl80M，rtM204V，rtM204I，rtAl81V检出率分别是32.73%、21.82%、21.82%、12.73%，而rtN236T，rtM207I检出率相对较低，分别是2.72%、1.82%。110例患者中HBV RT区发生基因耐药突变的有62例，其中有4例单独出现rtLl80M变异，产生耐药的有58例，总耐药率为52.73%。在58例耐药的患者中有 32例发生了rt180M+rt204I/V混合位点突变，占55.17%，12例（20.69%）独立发生了rt204I位点突变，11例（18.97%）独立发生了rt181V位点突变，提示rt180M+rt204I/V混合位点突变在患者中较为普遍，这与戚应杰等[9]报道相似。他们研究的rt180M+rt204I/V混合位点突变占总耐药例数41.9%，该研究的比例比他们略高，这可能与研究的人群不同有关。由此可见，经核苷（酸）类似物治疗CHB，停药后复发的患者耐药突变发生率较高。在本研究中，患者发生耐药的比例高低依次是LMV（52.73%），LDT（22.73%），ADV（14.55%），这与戴明佳等[10]报道基本一致。徐州地区的汪莉萍等[11]研究了抗病毒治疗前的自然耐药变异，100例CHB患者中发生自然耐药的有21例，发生率为21%，其中ADV 12例（12%），LMV 7例（7%），ETV 2例（2%）。本研究对象是经抗病毒药物治疗后停药复发的人群，LAM和LDT的耐药比例上升很明显，ADV略有升高。以上结果均提示在抗病毒药物的选择压力作用下，使得HBV基因组RT区的变异频率大大增强。24例患者对LMV和LDT耐药，比例是21.82%；14例对LMV和ADV双重耐药，比例是12.73%；2例对LMV、LDT、ADV多重耐药，比例是1.82%。LMV的耐药突变位点临床多见的主要是rtL180M+rtM204V/I，其中 rtM204V/I又称为YMDD变异，以rtM204I更为多见。如应用拉米夫定治疗1、2、3、4年后，YMDD变异率在分别为14%、38%、49%、66%。拉米夫定是我国最早和应用较广泛的核苷类抗乙肝病毒药物，rt204M发生YMDD变异而引起病毒学突破和生化指标反弹，导致其抗病毒治疗失败。此外，有4例患者单独出现了rtL180M突变，未出现rtM204V/I变异，而有1例单独出现rtM204V变异，这与蒋贝等[3]研究不同，他们报道的是LAM耐药突变类型中，所有的rtM204V会联合rtLl80M共同发生突变。这也许说明了YMDD变异患者除在rtM204发生变异外，rtL180M有原发性和补偿性变异[12]，这些变异与HBV复制及药物耐药的关系究竟如何有待进一步研究发现。ETV具有高耐药基因屏障，至少需要3个位点发生突变方可构成耐药。其耐药机制通过二次打击发生，即在rtM204I/V（±rtL180M）基础上，加上以下一个或多个位点包括B区rtI169T或rtT184S/G、C区rtS202I/G和E区rtM250V[13]。已证实rtM204V/I会降低HBV对ETV的敏感性[10]。ETV在NA初治患者中的耐药发生率很低，最初只在对 LAM耐药的患者中出现，有研究显示应用 ETV 3 年累积耐药率仅为1.7%～3.3%，但有LAM治疗失败史的患者其耐药发生率明显增高[9]。本研究共检出43例存在ETV耐药风险的患者，检出率39.09%，其都伴随LAM耐药，变异组合模式主要为rt180M+rt204V、rt204I、rt180M+rt204I。rt181 位点单一氨基酸改变即可能导致LAM 和 ADV 交叉耐药，本文检出11例rtA181V 独立突变。
本研究进行了影响HBV RT区基因耐药突变的因素分析，结果显示年龄、性别、基因型与HBV发生耐药突变无关（P > 0.05）。戴明佳等[10]也研究了195例患者既往有明确的应用NA史，B、C基因型间耐药发生率无明显差（P > 0.05）。
HBV可分为A～J 10种基因型[5]，基因型具有明显的地理分布特点，我国南方以B型多见，北方以C型为主，少数民族地区可见到一定比例的A型和D型[5，14-15]。在本研究中基因型检出情况与本地区的戴明佳等[10]报道相似，他们檢出C型93.92%，表明在本地区经诊疗的CHB患者HBV基因型以C型为主，主要是单基因型HBV感染，这与已有报道结果基本一致[16]。研究报道[17-19]，感染HBV C基因型患者比感染B基因型更容易出现严重的肝脏疾病，发生肝硬化和肝细胞癌的概率较高，且临床预后较差。
综上所述，经核苷（酸）类药物治疗的CHB患者停药复发后，尽早检测耐药变异，依据世界卫生组织指南[20]及时调整治疗方案，这对控制病情进展，减少病毒突破乃至反弹对机体造成的再次打击相当重要。
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