规范JJF1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》中对标准物质均匀性评估的技术要求，随机抽取15个包装单元，用数字PCR方法检测目标基因的拷贝数浓度进行标准物质均匀性检验。采用F检验法对均匀性测量数据进行了统计检验，结果见表3。由表可知研制的标准物质样品均匀一致，符合标准物质研制均匀性的要求。
2.4 标准物质稳定性考察
标准物质的稳定性是指在规定的时间间隔和环境条件下，标准物质的特性量值保持在规定范围内的性质。过敏源标准物质稳定性检验采用数字PCR方法进行测定。依据JJF1343-2012推荐的标准物质稳定性评价方法进行标准物质稳定性检验及评价，检验结果见表4，分析可知在12个月时间内标准物质特性量值无显著性变化，符合标准物质的稳定性要求，检验结果为稳定。
2.5 标准物质的定值
基因组DNA采用本文建立的数字PCR方法进行目标基因拷贝数的绝对定量检测，确定了虾16S基因和真核生物18S基因，葫芦卜真核生物18S基因的拷贝数。依据JJF1343-2012的要求和ISO导则34的要求，采用重量法配制过敏源基因组DNA标准物质，确定的标准值为拷贝数百分比值，为1%虾16S滇核生物185=1%。
2.6 标准物质的定值不确定度分析
定值结果不确定度主要从目标基因拷贝数数字PCR定量、标准物质的重量法配制、标准物质的不均匀性、标准物质的不稳定性等部分进行了考察。具体考察分析的不确定度来源鱼骨刺图见图2。
2.6.1 不确定度的量化
目标基因拷贝数数字PCR测量不确定度（UM）主要包括数字PCR校准、仪器稳定性、测量重复性3部分。仪器校准由校准证书得到，将其转化为相对标准物质不确定度计人标准物质特性量值的不确定度，仪器的稳定性和测量重复性由多次测量结果的相对标准偏差表示。标准物质重量法配制和样品的稀释配制产生的不确定度（uB）主要体现在天平称量方面，主要包含天平本身的不确定度和多次称量重复性两部分。不均匀性带来的不确定度（uH）和不稳定性带来的不确定度（uT）根据ISO导则35规定的计算方法进行计算。具体的量化结果见表5。
2.6.2 合成标准不确定度
以上不确定度分量互不相关，则合成标准不确定度为
虾过敏源标准物质合成标准不确定度为：u虾16S/真核18S=4.3%。
2.7 定值结果
定值结果表示为：标准值士扩展不确定度。取包含因子k=2，则扩展不确定度可以表示为U=k×u。虾过敏源定值结果为1.01%±0.09%。
3 数字PCR验证
将研制好的标准物质用数字PCR方法进行了特性量值验证，结果列于表6。
由表中数据可知，数字PCR的测量值与重量法配制值能够很好的符合，由此说明，数字PCR进行目标基因拷贝数的精确定量，然后根据需要采用重量法配制成需要的不同目标基因比值的标准物质是可行的。由于数字PCR方法是不依赖于外标准的绝对定量方法，现在越来越多的应用到目标基因的定量分析中，也逐渐成为基于目标基因定量的核酸标准物质权威定量方法;而重量法可以很好的实现设定基因比率样本的配制，且选择精度良好的天平可以有效减少重量法配制给标准物质特性量值带来的不确定度影响;因此，数字PCR和重量法结合很好的实现了不同物种间不同目标基因检测标准物质特性量值的确定，且准确度较高。
4 结束语
针对过敏源检测急需的目标基因检测标准物质稀缺问题，本文研究建立了基于数字PCR技术的目标基因拷贝数浓度确定方法，测定了虾16S基因和真核生物18S基因，葫芦卜真核生物18s基因的拷贝数，然后利用重量法配制了虾16S基因/真核生物18S基因DNA配比标准物质;评定了定值结果的不确定度，为基于目标基因检测的过敏源标准物质的研制提供了方法借鉴。
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（編辑：莫婕）