一、限制性核酸内切酶（限制酶）
1.限制酶的来源：在基因工程中，用来切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，又称限制酶。迄今为止，基因工程中所用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中分离纯化而来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。微生物中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完整的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。
2.限制酶的功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3.限制酶的作用特点：①限制酶是一类酶而不是一种酶，其成分均为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性、失活。②具有专一性。具体表现在两个方面：a.识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。b.切割特定序列中的特定位点。③可用于DNA的切割获取目的基因和切割载体。
4.限制酶的切割产物：
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。
二、DNA连接酶
1.DNA连接酶的作用特点、种类：
在基因工程中，将限制酶切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。DNA连接酶是一种能够催化DNA中相邻的3′＼|羟基（3′＼|OH）与5′＼|磷酸基（5′＼|P）末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的核酸酶。
根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一类是大肠杆菌中分离得到的，称为E·ColiDNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别：E·ColiDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
2.DNA连接酶与DNA聚合酶的区别：
①DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的DNA片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。②DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个切口同时连接起来，因此DNA连接酶不需要模板。
三、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
耐高温的DNA聚合酶，首先是由我国台湾科学家钱嘉韵从黄石公园的热泉中发现的嗜热菌中成功地分离出来的，在基因工程中用于PCR技术扩增目的基因时起催化作用的酶。PCR是一项在生物体外复制DNA片段的核酸合成技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。体内DNA复制首先要通过解旋酶的作用解开双链，而体外DNA的复制不需要解旋酶，是通过目的基因DNA受热（加热至90℃～95℃）变性后解链为单链的，以此两条单链为模板，在合成足够多的2种约20个脱氧核苷酸序列组成的引物的指导下，以dNTP为原料，按碱基互补配对原则，在Taq酶催化下，进行冷却（55℃～60℃）复性及适温（70℃～75℃）延伸，形成两个完全相同的DNA分子。
四、DNA聚合酶
1.原核生物DNA聚合酶：
原核生物中DNA聚合酶有三种：DNA聚合酶I、DNA聚合酶II、DNA聚合酶III。DNA聚合酶I由一条多肽链组成，含有928个氨基酸，分子量约为109000，除具有5′＼|3′聚合酶功能外，还具有3′＼|5′核酸外切酶和5′＼|3′核酸外切酶功能。DNA聚合酶II由一条多肽链组成，分子量约为90000。它具有5′＼|3′核酸聚合酶的功能外，还有3′＼|5′核酸外切酶的功能，但没有5′＼|3′外切酶的功能。DNA聚合酶III结构比较复杂，它至少有20个亚基组成，其全酶分子量达167500。它具有5′＼|3′核酸聚合酶的功能，也有3′＼|5′核酸外切酶的功能，但也没有5′＼|3′外切酶的功能。现在已证实DNA聚合酶III才是活体细胞内真正控制DNA合成的酶。
这三种聚合酶在决定DNA合成方面有一些共同的特性：①三种酶都只有5′＼|3′聚合酶功能，而没有3′＼|5′聚合酶功能，说明DNA链的延伸只能从5′向3′端进行。②它们都没有直接起始合成DNA的能力，只能在引物存在下进行链的延伸，因此，DNA的合成必须有引物引导才能进行。③三种酶还都有核酸外切酶的功能，可对合成过程中发生的错误进行校正，从而保证DNA复制的高度准确性。
2.真核生物DNA聚合酶：
真核生物中共有α、β、γ、δ和ε5种聚合酶。DNA聚合酶α和DNA聚合酶δ是DNA合成的主要酶，由DNA聚合酶α控制不连续的后随链的合成，而DNA聚合酶δ则控制前导链的合成，所以，其两条链的合成是在两种不同的DNA聚合酶的控制下完成的。DNA聚合酶β可能与DNA修复有关，而DNA聚合酶γ则是线粒体中发现的唯一一种DNA聚合酶。
五、RNA聚合酶
1.原核生物RNA聚合酶：
由DNA→RNA的转录过程，由RNA聚合酶催化。催化转录的RNA聚合酶是一种由多个蛋白亚基组成的复合酶。如大肠杆菌的RNA聚合酶有五个亚基组成，其分子量为480000，含有α、β、β′和δ等4种不同的多肽。其中α为两个分子，所以其全酶的组成是α2ββ′δ。α亚基与RNA聚合酶的四聚体核心（α2ββ′）的形成有关；β亚基含有核苷三磷酸的结合位点；β′亚基含有与DNA模板的结合位点；δ因子只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系，一旦转录开始，δ因子就被释放，而链的延伸则由四聚体核心酶催化。所以，δ因子的作用就是识别转录的起始位置，并使RNA聚合酶结合在启动子部位。
RNA链转录的起始首先是RNA聚合酶在δ因子作用下结合于DNA的启动子部位，并在RNA聚合酶的作用下，使DNA双链解开，形成转录泡，为RNA合成提供单链模板（3′＼|5′），并按碱基互补配对原则结合核苷酸，然后在核苷酸之间形成磷酸二酯键使其相连，沿5′向3′端方向延伸，形成RNA新链。δ因子在RNA链伸长到8～9个核酸后，就被释放，然后由核心酶催化RNA的延伸。因RNA聚合酶同时具有解开DNA双链，并使其重新闭合的功能，随着RNA的延伸，RNA聚合酶使DNA双链不断解开和重新闭合，RNA转录泡在不断前移，合成新的RNA链。当RNA链延伸遇到终止信号时，RNA转录复合体就发生解体，而使新合成的RNA链释放出来。
2.真核生物RNA聚合酶：
真核生物与原核生物RNA的转录过程总体上基本相同，但其过程要复杂得多。
①真核生物RNA聚合酶较多。在原核生物中只有一种RNA聚合酶催化所有RNA的合成，而在真核生物中则有RNA聚合酶I、RNA聚合酶II和RNA聚合酶III三种不同酶，分别催化不同种类型的RNA的合成。三种RNA聚合酶都是有10个以上亚基组成的复合酶。RNA聚合酶I存在于细胞核内，催化合成除5srRNA以外的所有rRNA的合成；RNA聚合酶II催化合成mRNA前体；RNA聚合酶III催化tRNA和小核RNA的合成。
②真核生物RNA聚合酶不能独立转录RNA。原核生物中RNA聚合酶可以直接起始转录合成RNA，真核生物则不然。在真核生物中，三种RNA聚合酶都必须在蛋白质转录因子的协助下，才能进行RNA的转录。另外，RNA聚合酶对转录启动子的识别，也比原核生物更加复杂。
六、逆转录酶
1970年，科学家在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶，该酶能以RNA为模板，根据碱基互补配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为逆转录。逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称作依赖RNA的DNA聚合酶。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。在体外催化由RNA合成cDNA过程的酶又称反转录酶。
大多数逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括：①DNA聚合酶活性：以RNA为模板，以dNTP为底物，以tRNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在tRNA3′—末端上，按5′→3′方向合成一条与RNA模板互补的cDNA单链，它与RNA模板形成RNA-cDNA杂交体。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNaseH（核酸酶H）活性：由逆转录酶催化合成的RNA-cDNA杂交体，将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性：以逆转录酶合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA单链，形成DNA双链。至此完成了由逆转录酶指导的以RNA为模板合成DNA的逆转录过程。
作者单位：河南省信阳市第二高级中学