摘要为探讨亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾 ［Plutella xylostella (L.)］ 体内活性酶的影响，采用叶片药膜法，用氯虫苯甲酰胺LC50和LC25剂量处理小菜蛾3龄幼虫24、48 h后，测定了幼虫体内羧酸酯酶、多功能氧化酶、谷胱甘肽S转移酶、乙酰胆碱酯酶等4种酶的活性变化。结果表明，亚致死浓度氯虫苯甲酰胺处理除对羧酸酯酶活性影响不显著外，对另3种酶活性均存在一定的抑制作用。谷胱甘肽S转移酶活性下降最明显，LC25和LC50处理小菜蛾24 h后，与对照相比分别下降92.57%和98.01%。
关键词氯虫苯甲酰胺；亚致死剂量；小菜蛾；解毒酶
中图分类号:Q 965.9文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.02.012Effects of sublethal concentrations of chlorantraniliprole on detoxifying
enzyme activity in Plutella xylostella（L.）Yin Fei,Feng Xia,Li Zhenyu,Lin Qingsheng,Hu Zhendi,Zhang Deyong,Chen Huanyu(Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangdong Provincial
Key Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou510640, China)AbstractTo clarify the effects of chlorantraniliprole at sublethal concentrations on the active enzymes of Plutella xylostella (L.)，the activities of 4 enzymes, carboxylesterase, function oxidase, glutathione Stransferase and acetylcholinesterase in P.xylostella were tested after the 3rd instar larvae were treated with sublethal doses of chlorantraniliprole (LC25 and LC50) by the leaf membrane bioassay. The results showed that 3 enzyme activities descended significantly except CarE, and glutathione Stransferase activity decreased the most obviously. When P.xylostella were treated with chlorantraniliprole at LC25 and LC50for 24 h,the activity of glutathione Stransferase decreased by 92.57% and 98.01%, respectively, compared with the control.
Key wordschlorantraniliprole;sublethal concentrations;Plutella xylostella;detoxifying enzymes 小菜蛾［Plutella xylostella (L.)］是一種世界性害虫，在我国各地发生严重，是十字花科蔬菜生产的头号害虫［1］。小菜蛾已经对多种杀虫剂产生了抗药性，包括有机磷、有机氯等传统杀虫剂、昆虫生长调节剂和苏云金杆菌等杀虫剂［2］。
氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole) 是双酰胺类广谱性杀虫剂，作用于鱼尼丁受体，具有高选择性［3］。其与鱼尼丁受体结合，通过激活钙离子通道，引起细胞内钙离子过度释放，使肌肉细胞不能收缩，害虫停止进食，表现出乏力、反胃和肌肉瘫痪等症状，最后死亡［46］。氯虫苯甲酰胺不仅能有效控制鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫，而且无交互抗性，可有效防治已对其他杀虫剂产生抗药性的害虫［78］。
杀虫剂施用于田间后，受到外界环境条件的影响或活体内酶系的作用，其毒力会随着时间延续而逐渐递减至亚致死剂量。药剂量不足以使昆虫致死，而使昆虫生态行为、发育历期、繁殖力和抗性改变，即产生亚致死效应，进而引起目标害虫猖獗发生［9］。本研究用亚致死浓度氯虫苯甲酰胺处理小菜蛾后，观察其体内4 种活性酶比活力的变化，寻找小菜蛾体内活性酶的应激效应。以期为探讨氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的毒杀作用提供理论依据，指导田间适时适量合理使用氯虫苯甲酰胺。
1材料与方法
1.1供试昆虫
田间（2012年10月，雷州市蔬菜田）采集小菜蛾老熟幼虫和蛹，置于25 ℃，相对湿度65%~70%，光照L∥D=16 h∥8 h 的养虫室饲养，待其羽化后，补充10%蜂蜜水，用菜心苗供成虫产卵，幼虫孵化后饲养至3龄初期进行试验。
40卷第2期尹飞等：亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾体内活性酶的影响20141.2供试药剂
5%氯虫苯甲酰胺水分散粒剂(美国杜邦公司)，α乙酸萘酯(广州齐云生物技术有限公司，化学纯)，固蓝B(上海华蓝科技有限公司)，对硝基苯甲醚(pNA) (瑞士Adamasbeta 公司，分析纯)，2，3二氯硝基苯(DCNB)（扬中市天力化工有限公司），还原型辅酶Ⅱ(NADPH) (Roche，进口分装)，牛血清蛋白和考马斯亮蓝G250（上海蓝季科技发展公司），其他试剂均为国产分析纯。
1.3生物测定
采用叶片药膜法。用洁净甘蓝（Brassica oleracea Bail），剪成直径6.5 cm圆片（避开主叶脉）。将叶片在药液中浸泡10 s后取出晾干（25 ℃，2 h），将晾干叶片置于直径6.5 cm 培养皿中， 接入10 头3龄初幼虫，覆盖双层吸水卷纸，盖上培养皿上盖。将其正面向上置于温度（25±1）℃， 相对湿度65%~70%，光照比L∥D=16 h∥8 h 的培养箱中。每处理6次重复。48 h 后检查死亡率，计算毒力回归方程、LC25、LC50值及其置信区间。
1.4氯虫苯甲酰胺亚致死浓度对小菜蛾幼虫体内解毒酶活性的影响分别用LC50和LC25处理小菜蛾3龄初幼虫10头，重复6次，共120头（方法同1.3）。分别于处理24 h和48 h后挑取存活幼虫，测定处理小菜蛾体内酶的活性变化。
解毒酶活性测定采用分光光度法。羧酸酯酶（CarE）活性参照夏冰等［10］改进的方法测定。谷胱甘肽S转移酶（GSTs）活性参照梁沛等［11］改进的方法测定。乙酰胆碱酯酶（AchE）活性参照孟琳琳等［12］的方法测定。多功能氧化酶（MFOs）参照Yu等［13］的方法测定。
1.5蛋白含量测定
参照Bradford 考马斯亮蓝G250 方法［14］。
1.6数据分析
毒力回归方程、LC25和LC50值计算、Duncan新复极差法多重比较均使用DPS软件。
2结果与分析
2.1氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的毒力
根据生物活性测定结果，利用几率值分析法建立氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的毒力回归方程为：y=4.325 2+1.445 8x，r=0.978 7，LC50=2.93 mg/L；LC25=1.05 mg/L。
2.2亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾体内羧酸酯酶活性的影响由表1 可知，LC25和LC50处理小菜蛾24 h和48 h后，其体内羧酸酯酶活性与对照相比差异不显著（P>0.05）。LC25和LC50处理小菜蛾后，其体内羧酸酯酶活性存在一定的浓度效应。LC50处理小菜蛾24和48 h后，处理组与对照组相比小菜蛾体内羧酸酯酶活性分别降低69.23%和38.46%。
表1亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾
体内羧酸酯酶活性的影响1)
Table 1Effects of chlorantraniliprole at sublethal
concentrations on the activity of CarE in Plutella xylostella处理
Treatment比活力/A·min-1·mg-1pro
Specific activity24 h48 hLC50(0.04±0.03)a (0.08±0.03)aLC25(0.12±0.04)a(0.42±0.28)aCK(0.13±0.08)a(0.13±0.08)a
1) 表中数据是4次重复的平均值；同一列数据后不同小写字母表示同组数据彼此间在0.05水平上差异显著（P<0.05）。
Data in the table are mean of 4 replicates; Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.
表2亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾
体内乙酰胆碱酯酶活性的影响1)
Table 2Effects of chlorantraniliprole at sublethal
concentrations on the activity of AchE in P. xylostella處理
Treatment比活力/A·min-1·mg-1pro
Specific activity24 h48 hLC50(1.60±0.05)b(2.22±0.18)bLC25(2.71±0.24)ab(2.82±0.06)abCK(3.97±0.63)a(3.97±0.63)a
1)表中数据是4次重复的平均值； 同一列数据后不同小写字母表示同组数据彼此间在0.05水平上差异显著（P<0.05）。
Data in the table are mean of 4 replicates; Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.2.3亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾体内乙酰胆碱酯酶活性的影响由表2可知，LC25和LC50处理小菜蛾24和48 h后，其体内乙酰胆碱酯酶活性均显著下降，且表现出一定的浓度效应。LC25和LC50处理小菜蛾24、48 h后，其体内乙酰胆碱酯酶活性与对照相比分别降低31.74%和59.70%；44.08%和28.97%。处理浓度越高抑制效果越明显。2.4亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾体内多功能氧化酶活性的影响由表3可知，LC25和LC50处理小菜蛾24和48 h后，其体内多功能氧化酶活性与对照相比差异显著（P<0.05）。LC50与LC25处理小菜蛾24 h后，小菜蛾体内多功能氧化酶活性与对照相比分别下降31.25%和68.75%；处理48 h后，小菜蛾体内多功能氧化酶活性与对照相比分别下降64.58%和18.75%。表明小菜蛾3龄幼虫经过氯虫苯甲酰胺处理以后，其体内多功能氧化酶活性受到不同程度的抑制，且表现出一定的浓度和时间效应。
表3亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾
体内多功能氧化酶活性的影响1)
Table 3Effects of chlorantraniliprole at sublethal
concentrations on the activity of MFOs in P.xylostella处理
Treatment比活力/A·min-1·mg-1pro
Specific activity24 h48 hLC50（0.33±0.02）b(0.17±0.01)cLC25（0.15±0.01）c(0.39±0.02)bCK(0.48±0.03)a(0.48±0.03)a
1)表中数据是4次重复的平均值；同一列数据后不同小写字母表示同组数据彼此间在0.05水平上差异显著（P<0.05）。
Data in the table are mean of 4 replicates; Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.
2.5氯虫苯甲酰胺亚致死剂量处理对小菜蛾体内谷胱甘肽 S转移酶活性的影响由表4可知，LC25和LC50处理小菜蛾24 h后，其谷胱甘肽 S转移酶活性与对照相比差异显著（P<0.05），分别下降92.57%和98.01%。随着处理时间的延长LC50处理的小菜蛾谷胱甘肽 S转移酶活性与对照相比继续显著下降，而LC25处理后小菜蛾体内谷胱甘肽 S转移酶活性随时间的延长有所增加。说明不同浓度氯虫苯甲酰胺处理小菜蛾后，小菜蛾体内谷胱甘肽 S转移酶在不同时间的响应不同。
表4亚致死剂量氯虫苯甲酰胺对小菜蛾
体内谷胱甘肽 S转移酶活性的影响1)
Table 4Effects of chlorantraniliprole at sublethal
concentrations on the activity of GSTs in P.xylostella处理
Treatment比活力/A·min-1·mg-1pro
Specific activity24 h48 hLC50(0.71±0.28)b(0.46±0.27)bLC25(0.19±0.11)b(10.05±1.54)aCK(9.61±1.04)a(9.61±1.04)a
1) 表中数据是4次重复的平均值； 同一列数据后不同小写字母表示同组数据彼此间在0.05水平上差异显著（P<0.05）。
Data in the table are mean of 4 replicates; Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.
3讨论
杀虫剂的亚致死效应给害虫提供了持续的选择压力，加快了害虫抗药性的产生。近年来，药剂的不合理使用使害虫的抗药性不断增强，目标害虫猖獗发生，次要害虫上升为主要害虫，杀虫剂对昆虫的亚致死效应成为研究热点之一。氯虫苯甲酰胺广泛应用于田间后同样存在亚致死效应。邢静等研究表明小菜蛾对氯虫苯甲酰胺产生抗性的风险较高［14］。在用药频率明显较高的地区，小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性已达中等水平［1516］。研究新型药剂氯虫苯甲酰胺亚致死浓度对小菜蛾的影响，对氯虫苯甲酰胺使用剂量及轮换用药进行指导，降低杀虫剂对小菜蛾的选择压是延缓其抗药性发展的重要措施。
谷胱甘肽 S转移酶是由多个基因编码、具有多种功能的超家族酶。它能使外源性或内源性的毒素分子失活而转变为水溶性化合物以达到初步解毒的作用，因而是多种生物体内主要的Ⅱ相解毒系统，与许多生理及异源物质的排泄有关［1718］。多功能氧化酶是昆虫体内一类重要的氧化代谢酶系。乙酰胆碱酯酶（AchE） 能够迅速水解兴奋性神经递质乙酰胆碱(ACh)而保持神经突触传递的正常功能［19］。在靶标抗性中，乙酰胆碱酯酶(AchE)敏感性降低是抗性产生的主要原因之一，通过抑制中枢神经系统中AchE对神经递质Ach的水解作用，干扰和最终阻断突触传导而发挥它们的毒效。本研究表明，亚致死剂量氯虫苯甲酰胺短时间处理小菜蛾后其体内谷胱甘肽 S转移酶、多功能氧化酶、乙酰胆碱酯酶活性显著降低，说明氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的毒杀作用可能与此3种活性酶有关。研究结果为进一步探讨该杀虫剂对小菜蛾的杀虫作用有一定参考价值。
本研究中对小菜蛾体内活性酶比活力的测定是在氯虫苯甲酰胺短期胁迫下进行的，要明确这些活性酶是否真正参与了小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性，需进一步系统地研究。
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