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1Mgi6LmvuPTڨx },Phߞ ]&sFrbLmC4uimnKB/w}9~,N 4]Mt]7N5ӝt];rbz/]O 4HP Dq&9&7piomvwMMܢwO Eky"http://www.51feid.com/keys/baogao.html" target="_blank" class="keylink">报告基团混合，能同时检测基因序列不同的病原体，在国内外蓬勃发展[12-14]。传统PCR技术检测疟原虫需要经过多轮扩增或使用多对引物同时扩增才能鉴别，凝胶电泳费时且难以自动化。本实验旨在单管一步反应获得直观结果，简化实验步骤。
我国疟疾消除计划初显成效，近年来病例多为输入性感染，大量用药导致耐药发生，检测疟原虫隐蔽性及困难程度增加。镜检诊断疟原虫对技术人员专业要求高，且容易漏诊。部分地区实验室镜检技术力量薄弱，一线医技人员对疫情不能及时检验[15]，PCR快速检测在出入境关口能克服显微镜的限制，阳性检出率高[16，17]，且不受耐药寄生虫影响，应用广泛[18]。我市患者多为恶性疟或间日疟感染，快速准确鉴别虫种对合理治疗有重大意义。
目前国外学者Phuong M等[19]针对地区优势疟原虫种类设计两、三重荧光探针，不能同时鉴定四种疟原虫。国内学者黄雨婷[7]、李美等[20]检测四种疟原虫，巢氏引物扩增后经核酸胶鉴定虫种，曲线的Tm值集中，不易区分和鉴别虫种。
本实验通过对以上方法的综合和优化，调整反应条件、浓度、荧光探针，建立单管中能同时检测四种疟原虫的多重PCR探针系统。本实验方法操作简单，从提取DNA到读出结果在3 h内完成，该系统可对除wallikeri亚种之外的疟原虫进行分型，但疟原虫属保守18S小亚基核糖体基因设计的通用上下游引物可检测出所有疟原虫病原体，以此可应对疟原虫多个基因型差异[21]。本研究的20份样本均已确诊，使用自建方法得出预期结果，通过反应可区分出四种疟原虫。混合血样中加入人基因组，可测得通用、恶性、间日疟特异性扩增，应对混合感染[22]。三个复孔检测曲线呈高度相关性，变异系数<5。对质粒标准品倍比稀释的梯度浓度进行检测，结果显示较好的相关性。四种疟原虫最低检测限均<103 copies/mL，恶性疟可达102 copies/mL，该灵敏度优于其他方法，且有利于混合感染的检测，进一步满足日常检测工作需要。在灵敏度与重复性检测中，梯度浓度相关曲线系数R2>0.98，表明标准品定量可靠。PCR操作过程中需注意污染，且由于本体系引物探针众多，需保证序列质量及保存恰当。为了最大限度获得特异性扩增，本实验优化反应条件及体系浓度，增加特异性及敏感性。上述检测结果显示自建方法高灵敏度、特异性和稳定性，适合在出入境、检验检疫等部门推广应用。
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（收稿日期：2016-04-19）