摘要[目的]对桃拉病毒（Taura syndrome virus，TSV）的完整基因组进行生物信息学分析。[方法]通过生物信息学方法对基因序列组成、开放阅读框、蛋白质理化性质、二级结构预测分析、蛋白跨膜结构的存在与否、蛋白信号肽存在与否以及蛋白质三级结构进行了预测分析。[结果]登录NCBI网站下载TSV（JX094350.1）10 128 bp的基因片段，经生物信息学分析，编码氨基酸3 286个，理论等电点（pI）为 5.14，相对分子质量为366 443.00 Da，不稳定系数（Ⅱ）为37.76，属于稳定蛋白质；完整基因序列中包含2个开放阅读框（open reading frame，ORF）；蛋白中存在跨膜结构；没有蛋白信号肽。[结论]对TSV的生物信息学分析有助于在分子水平上了解桃拉病毒的基因结构以及预测其感染机制，可为预防和治疗虾类的桃拉综合征提供有用的信息。
关键词 桃拉病毒；基因；蛋白质；生物信息学分析
中图分类号S945.4文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）08-0119-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.030
Abstract[Objective]To make bioinformatics analysis on Taura syndrome virus （TSV） gene in swine.[Method]The complete genes of TSV were analyzed by bioinformatics software，including its gene sequence analysis，open reading frame prediction（ORF） prediction，physicochemical properties of protein，secondary structure prediction，protein transmembrane and signal peptides prediction，and as well as protein tertiary structure prediction.[Result]The TSV gene （JX094350.1） with a length of 10 128 bp was successfully obtained from NCBI gene bank.The bioinformatics analysis showed that TSV gene was a total of 3 286 amino acids，a theoretical isoelectric point （pI） of 5.14，a theoretical molecular mass of 366 443 Da，and an instability coefficient （Ⅱ） 37.76，being a stable protein.The complete gene sequence contained two open reading frames （ORFs）.There was a transmembrane structure in the protein，and there was not included protein signal peptide.[Conclusion]The bioinformatics analysis of TSV is helpful for understanding Taura syndrome virus on molecular level and the prediction of infection mechanism.It will provide useful informations for the prevention and treatment of Taura syndrome.
Key wordsTaura syndrome virus；Gene；Protein；Bioinformatics analysis
1994年，Lightner等[1]在患有桃拉綜合征（taura syndrome，TS）的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）中发现了桃拉病毒（Taura syndrome virus，TSV），之后被Hasson等[2]证实并命名。TSV是一种直径为31～32 nm的非包覆二十面体颗粒，是单链正链RNA，属于小RNA病毒粒子家族[3]。TSV能够感染许多对虾种类，自然宿主如凡纳滨对虾和中国对虾（Penaeus chinensis）[4]。不同对虾品种对TSV的敏感度不同，其中凡纳滨对虾敏感度较高，野生型凡纳滨对虾仔虾对TSV的抵抗力比人工孵化仔虾的更高[5]。TSV大多数情况下倾向危害体重较轻的幼虾，幼虾的累积死亡率高达40%～90%[6]。TSV感染共3个阶段，分别为急性期、过渡期和慢性期。在急性期，虾表皮上皮组织切片中可以看到典型的病理损伤，而在过渡期和慢性期则无。多数病虾属于急性期感染，急性期感染的大多数病虾胡须和尾巴的体表变红，且尾扇边缘会变成茶红色，外壳比较柔软；基本不进食，极少数可能会少量进食；常在水面缓慢游动。个别幸存病虾将进入到过渡期，过渡期仅有数天，但半数左右的病虾会于甲壳上留下不规则的黑斑[7]。随后进入长时间的慢性期，处于慢性期的病虾成为病毒携带者，可将病毒水平传播给其他易感虾群。我国的多数对虾养殖区由于养殖规模的不断扩大，已经出现了严重的桃拉综合征发病现象，因此了解TSV分子生物学信息对于防治此病可以提供信息帮助，而生物信息学相关分析可以满足这一现实需求。
生物信息学是继人类基因组计划之后的一门新兴学科，其将数学、计算机和生物学相关内容联合起来处理生物信息，对信息进行获取、加工、存储、分配、分析和解释。生物信息学主要研究内容包括核酸序列、蛋白质序列以及从其中获得的一些数据。生物学研究正在由传统实验观察阶段扩展到推理演算阶段，目前已有很多关于核酸和蛋白质的生物学数据库存在[8]。笔者基于生物信息学的方法，通过相关软件对TSV进行了生物信息学分析，旨在解析该病毒在分子生物学方面的一些信息，为研究预防和治疗桃拉综合征提供信息帮助。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1序列信息。
在NCBI（national center for biotechnology information，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Nucleotide选项内可以查出TSV完整基因序列。
1.1.2分析软件。TSV生物信息学分析软件见表1。
1.2方法
1.2.1TSV基因序列信息。
NCBI中收录了世界各国科学家提交的基因序列、大多数期刊论文所研究过的基因序列以及各专利中公布的基因序列，因此它的集成化程度是现有生物学数据库中最高的。各国家科学家提交注册的基因序列、各种期刊论文报道的基因序列和各种专利中公开的基因序列均被收录在NCBI中，并每24 h更新数据库内容[9]。
利用NCBI在线网站中的Nucleotide数据库，对TSV进行搜索，得到完整的基因序列。
1.2.2TSV基因序列的组成分析。BioXM本地软件的编制和运行对于计算机软硬件所处的环境要求不高，基本Windows系统均可以运行，进行基因序列组成分析时采取的算法是通读全部序列[10]，因此可直接将序列放入分析框。
利用BioXM本地软件，对所得到的完整基因序列进行组成成分分析。
1.2.3TSV开放阅读框架分析。ORF是可编码蛋白质的一段碱基序列，其代表蛋白结构数目[11]。ORF Finder是生物信息服务平台中的一种，可在数据库中寻找编码框，查询可能存在的蛋白质编码区域[7]。
利用ORF Finder在线软件，对TSV完整基因序列的ORF出现位置进行检索，需满足以下条件：最小ORF长度（NT）为600，遗传密码使用起始密码子 “ATG”，忽略嵌套ORFs。
1.2.4TSV蛋白质理化性质分析。蛋白质一级结构指多肽链内氨基酸残基由N末端到C末端的顺序排列，也称之为基本结构。根据ORF Finder确定的TSV蛋白质一级结构预测分析，进行理化性质分析。
将获取的ORF结果和Translate Tool软件得到氨基酸序列通过ProtParam在线软件（http：//au.Expasy.org/）进行理化性质分析，主要包括蛋白质理论分子量、氨基酸组成、理论等电点、理论不稳定系数以及疏水性等参数[12]。
1.2.5TSV蛋白质二级结构预测与分析。
多肽主链在空间中盘绕、折叠可构成一种立体结构形态，将其称之为蛋白质二级结构。此结构包括无规卷曲、β转角、延伸链和α螺旋等，它不仅是一级结构与三级结构之间的连接，而且是预测三维空间结构的重要环节。通过SOPMA在线软件，采用5种方法（Levin同源预测方法、CNRS方法、GOR方法、PHD方法和双重预测方法）对蛋白质二级结构进行分析和预测，将预测结果汇集整理 [13-14]。
1.2.6TSV蛋白质序列的跨膜结构。
膜蛋白拥有独特的结构，并担负着许多细胞生物功能，如细胞之间信号传导，物质运输以及免疫等[15]。因此，预测蛋白质跨膜结构是否存在十分重要。利用TMHMM在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对TSV基因编码的蛋白质是否存在跨膜结构进行预测[16]。
1.2.7TSV蛋白信号肽分析。
信号肽由氨基酸组成，通常处于分泌蛋白的N端。它负责把蛋白质引导至细胞含不同膜结构的亚细胞器内，作用不可替代，可以用来分析蛋白质的细胞定位[17]。通过Signal P-4.1 Server隐马尔可夫模型（HMM）算法在线对TSV基因编码的蛋白质中是否存在信号肽进行分析预测[18]。
1.2.8TSV蛋白质三级结构预测与分析。
蛋白质三级结构是一种特定的立体构象，其是多肽链利用侧链基团之间相互作用发生卷曲折叠，并依靠次级键维系而形成。同源建模法、折叠识别法（串线法）和从头预测法是蛋白质三维结构普遍的预测方法，其中同源建模法是最常用的方法，可通过生物信息学软件Expasy中的SWISS-MODEL软件对TSV蛋白质三级结构的立体构象进行预测[19]。
2结果与分析
2.1TSV基因序列信息
利用NCBI网站获得TSV基因序列，该基因序列号为JX094350.1，总长度为10 128 bp，并将其以FASTA格式下载到本地文件夹内。
2.2TSV基因序列的组成分析
BioXM软件结果显示，序列长度为10 128 bp；腺嘌呤核苷酸（A）共2 869个，占总核苷酸的28.33%；鸟嘌呤核苷酸（G）共2 311个，占总数的22.82%；胞嘧啶核苷酸（C）共2 061个，占总数的20.34%；尿嘧啶核苷酸（U）共2 887个，占总数的28.51%；A+U的含量（56.84%）高于G+C的含量（43.16%）；分子量为3 121 404 Da。
2.3TSV开放阅读框架（ORF）分析ORF Finder软件在线分析结果见图1，在满足最小ORF长度（NT）为600、遗传密码使用起始密码子 “ATG”并忽略嵌套ORFs条件下，TSV基因潜在的编码框共2个，其中ORF1由第6 878～9 913位之间的1 011个氨基酸组成，ORF2由第312～6 671位之间的2 119个氨基酸组成。
2.4TSV蛋白质理化性质分析
TSV基因共编码3 286个氨基酸，将氨基酸序列导入分析软件，结果见表2。由表2可知，疏水性氨基酸包括丙氨酸（A）、异亮氨酸（Ⅰ）、亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、缬氨酸（V）共1 077个，占氨基酸总数的32.8%；极性氨基酸包括天冬酰胺（N）、半胱氨酸（C）、谷氨酰胺（Q）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、酪氨酸（Y）共1 006个，占氨基酸总数的30.6%；强碱性氨基酸包括赖氨酸（K）和精氨酸（R）共305个，占9.3%；强酸性氨基酸包括天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）共430个，占氨基酸总数的13.1%；稀有氨基酸中只含有吡咯賴氨酸（Pyl）2个，占氨基酸总数的0.1%，不含有硒半胱氨酸（Sec）。同时可得知，理论等电点（pI）为5.14；相对分子质量为366 443 Da；原子组成为C16157H25346N4360O5098S131；不稳定系数（Ⅱ）为37.76，属于稳定蛋白类；脂肪系数为82.49；平均亲水性为-0.284。
2.5TSV蛋白二级结构预测与分析
通过SOPMA对TSV蛋白在线分析，结果见图2。由图2可知，其中α螺旋占37.70%，延伸链占18.43%，β转角占7.54%，无规则卷曲占36.33%，以α螺旋和无规则卷曲结构为主。
2.6TSV蛋白质序列的跨膜结构
通过跨膜结构分析程序Expasy的HMHMM在线对TSV进行跨膜结构预测分析。结果如图3所示：横坐标代表氨基酸顺序位置，纵坐标代表该区域是跨膜区的概率，大于0.5表示该区域具有跨膜螺旋的可能性大，小于0.5则可能性小；红线和蓝线分别代表膜外和膜内区域，两者交互位置表示出现跨膜[20]。由图3可知，TSV基因编码的蛋白质存在跨膜区域。
2.7TSV蛋白信号肽
通过SignalP-4.1在线软件对TSV基因编码的蛋白信号肽存在与否进行预测，结果如图4所示，Cscore代表剪切位点的值，此值与氨基酸一一对应，C值最高处通常是剪切位点；Sscore代表每个氨基酸对应一个值并连接成曲线表明变化趋势，值较高的区域可能为信号肽区域；Yscore同时考虑S值和C值，比单独的C值或S值更准确[21]。因为典型信号肽的结果图中Cscore和Yscore均向+1靠近，Sscore曲线则在切点前高，在切点之后变低[22]，数据显示TSV基因编码的蛋白质存在信号肽的可能性为0.112，因此预测不存在信号肽。
3结论
在NCBI中现有的TSV基因中总长虽有所不同，但均表明TSV基因有2个ORF，与该研究的结果一致。目前对于桃拉病毒的研究主要集中在TSV的分离、鉴定和检测等方
面[23]，没有针对其全基因组在蛋白质结构预测方面的研究。通过对TSV基因（JX094350.1）生物信息学分析，得到了在分子水平上TSV基因组更多的信息，为进一步研究提供了便利和经验，同时也为预防和治疗桃拉综合征提供重要信息。
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