摘要：红色特种籼稻是一种极其珍贵的特色稻米资源，稻瘟病是红色特种籼稻的主要病害，培育抗稻瘟病品种是防治稻瘟病的有效途径。以含广谱稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的BL122为供体，红色特种籼稻桂红一号为受体，通过杂交、回交和自交并结合分子标记辅助选择，将Pi1和Pi2基因导入红色特种籼稻桂红一号中，获得了携带2个抗性基因的高抗稻瘟病改良材料。对BC3F3代材料进行了苗期和成熟期稻瘟病抗性鉴定，结果表明，携带2个抗性基因的目标株系抗性均达到抗以上水平，部分株系达到高抗水平，稻瘟病抗性显著高于轮回亲本。统计分析表明，BC3F3改良材料与对照相比，有效穗数和理论产量显著增加，而在其他农艺性状方面无显著差异。通过分子标记辅助选择获得的改良材料为红色特种籼稻的抗稻瘟病育种创制了新的种质资源。
关键词：红色特种籼稻；分子标记辅助选择；稻瘟病；基因聚合；Pi1；Pi2
中图分类号：S511.2+1；S435.111.4+1 文献标识码：A
文章编号：0439-8114（2018）18-0023-05
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.005 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Improvement of Rice Blast Resistance in Red Rice by Pyramiding of Pi1 and Pi2 through Molecular Marker-Assisted Selection
SUN Fu，TANG Mei，HE Cong，LU Hong-cong
（Rice Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding，Nanning 530007，China）
Abstract： Red rice is an extremely precious characteristic rice resource. Blast is one of the most serious rice diseases worldwide，which usually leads to a sharp decline in rice yield and even results in no yield. Breeding blast-resistant varieties is one of the most effective and economical ways to control the disease. In this study，BL122 containing two blast resistance genes Pi1 and Pi2 was used as gene donor to be crossed and then backcrossed with red rice variety Guihong 1. The improved materials of high resistance to rice blast with two resistance genes were obtained. The resistance identification of rice blast in seedling stage and mature stage of BC3F3 was carried out. The results showed that the resistance of target strains with two resistance genes was all above the resistance level，and some strains reached high resistance level. The resistance of these strains to rice blast was significantly higher than that of the recurrent parent. Statistical analysis showed that，compared with the control，the effective panicle and theoretical yield of BC3F3 were significantly increased， while there was no significant difference in other agronomic traits. The improved materials obtained through molecular marker-assisted selection is a new breeding resource for the breeding of red rice.
Key words： red rice； molecular marker-assisted selection； rice blast； gene pyramiding； Pi1； Pi2
紅色特种籼稻是中国极其珍贵的特色稻米资源，其米饭不但芳香爽口，而且营养比较全面合理，长期以来，作为老弱病孕的营养滋补品，享有“补血米”“药米”“长寿米”之美称，是比较理想的保健食品资源之一[1]。与白米相比，红米含有较多的蛋白质和氨基酸，较多的矿质元素，如铁、锌、锰、硒、钙、钼、磷及维生素C、维生素B2、维生素B6、维生素B12、胡萝卜素等，更值得一提的是，红米中所含的黄酮类化合物比黑米还高[2，3]。红米成熟以后种皮才变红，其中的色素又叫浓缩丹宁酸，红色色素是其营养丰富的原因，也是具有食疗价值的原因[3]。红米具有升高血浆高密度脂蛋白胆固醇和提高机体抗氧化能力的作用，可以减缓或改善动脉粥样硬化、癌细胞生长、辐射损伤、关节炎等症状。在中国，红色特种籼稻已有数千年的栽培历史，但目前在生产上应用的红色特种籼稻品种的稻瘟病抗性弱，给红米生产带来严重危害，稻瘟病发病严重时其植株枯萎死亡，产量大幅下降，严重时可达50%。鉴于此，有必要将红色特种籼稻稻瘟病抗性进行改良，培育出抗性强的新品种。分子标记辅助选择（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）是直接利用与目标基因紧密连锁的分子标记对其进行选择，是一种高效的抗病育种方法。研究表明， 持久抗性与多个抗病基因协同作用密切相关。许多具有持久抗性的种质如Moroberekan、Tetep、IR64、三黄占等都具有多个抗病基因[4，5]。多个抗性基因的聚合后，并不简单地表现为单个抗病基因的抗谱之间的累加，而是抗性基因之间表现为极显著的基因互作，协同抵抗单个抗病基因不能抵抗的生理小种，这是多基因聚合后抗谱拓宽、抗性增强的重要原因，因此基因聚合是培育稻瘟病持久抗性的有效方法。来源于西非粳稻品种LAC23的Pi1和哥伦比亚籼稻品种“5173”的Pi2基因是两个显性广谱高抗稻瘟病基因[6，7]。Hittalmani等[8]利用分子标记辅助选择技术将抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pita聚合到了同一个水稻品系BL124中。陈红旗等[9]利用分子标记技术聚合Pi1、Pi2和Pi33基因改良金23B的稻瘟病抗性，结果表明，改良后的保持系对稻瘟病的抗病频率为96.7%，明显高于仅携带单个基因的抗病性。柳武革等[10，11]以含广谱稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的BL122为供体，温敏核不育系GD-7S、三系不育系荣丰A为受体，通过杂交、回交和自交并结合分子标记辅助选择，将Pi1和Pi2基因导入到 GD-7S和荣丰A中，提高了GD-7S和荣丰A的稻瘟病抗性。目前，抗稻瘟病基因多以导入水稻不育系[12]和恢复系[13]当中为主，而将广谱抗稻瘟病基因Pi1和Pi2基因聚合导入到红色特种籼稻的研究还未见报道。本研究以高产优质的红色特种籼稻品种桂红一号为受体材料，与聚合有抗稻瘟病基因Pi1和Pi2的抗性材料BL122杂交，把Pi1和Pi2导入到其中，以培育出具有高抗稻瘟病的亲本材料，为红色特种籼稻的稻瘟病抗性种质创新，培育出高抗稻瘟病的红色特种籼稻品种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
含稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2的供体亲本BL122是由国际水稻研究所育成的多基因累加系，其遗传背景为籼稻品系CO39，在广西多年鉴定表现持久高抗稻瘟病特性，种子由广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室高利军副研究员提供，受体亲本桂红一号由广西农业科学院水稻研究所育成提供。稻瘟病鉴别菌系主要为广西岑溪市病原菌，由广西农业科学院植物保护研究所提供。
1.2 抗性基因的分子标记检测
采集水稻幼嫩叶片用CTAB法快速提取DNA[14]，与稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2紧密连锁的标记M-Pi1（正向引物序列5′-GTGCTGCTGTGGCTAGTTTG -3′，反向引物序列5′-AGTCCCCGCTCAATTTTTCT-3′）和Pi2Dom（正向引物序列5′-TCTCTCTTAGCTGATCCAAGTCA-3′，反向引物序列5′-GCAGGAAT CTCAGATGGTGG-3′）由高利军副研究员设计开发，引物由深圳华大基因公司合成。PCR反应体系为20 μL的体系，含2.0 μL 10×Buffer，0.4 μL dNTP，正反引物各1.0 μL，0.2 μL Taq酶，2.0 μL模板DNA，13.8 μL ddH2O。PCR反应程序94℃ 5 min，然后35个循环94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳，核酸染料染色后，凝胶成像仪拍照，并记录结果。
1.3 杂交、回交与选择方案
桂红一号×BL122获得F1，然后以桂红一号为母本与F1回交获得BC1F1。为加快改良进程，在此后的回交过程中，通过单株的表现和分子标记检测结果，在各回交世代中同时携带Pi1和Pi2两个抗性基因，农艺性状与轮回亲本接近的单株进行回交，回交3代后选择同时携带2个目的基因并与轮回亲本接近的单株进行自交。整个改良过程包括1次杂交产生F1，3次回交和2次自交，最后获得抗稻瘟病的BC3F3株系（图1）。
1.4 稻瘟病抗性鉴定
稻瘟病抗性鉴定分自然病圃鉴定和人工接种鉴定。自然病圃鉴定选择在稻瘟病重发区广西金秀县罗香乡进行，叶瘟和穗颈瘟按国际水稻研究所的分级标准进行调查；人工接种鉴定在广西农业科学院水稻研究所的隔离温室进行，每份材料30株，均设抗感对照，待幼苗长至三叶一心期时，喷雾接种，喷雾量为每100株苗30 mL接种液，24 ℃保湿培养48 h，10～13 d后，采用目测法调查病斑大小。病斑反应型分为9级：0、1、2、3级为R（抗），4、5、6、7、8、9级为S（感）。
2 结果与分析
2.1 利用分子标记辅助选择聚合Pi1和Pi2基因
以桂红一号为母本，BL122为父本配制杂交组合，然后以桂红一号为轮回亲本连续回交。从BC1F1世代开始分别利用目标基因Pi1和Pi2紧密连锁标记M-Pi1、Pi2Dom检测基因型，选择标记为有带型且农艺性状与轮回亲本接近的单株回交。经过连续3次回交获得BC3F1代后自交，BC3F3分离世代选择标记为纯合抗性基因型且农艺性状优良的单株。在分蘖盛期，分别利用分子标记检测对BC1F1群体的105个单株进行分子检测。Pi1基因的扩增产物大小为460 bp，Pi2基因的扩增产物大小为322 bp。经统计，在BC1F1群体中共检测到具有460 bp带型的单株72个，具有322 bp带型的单株81个。共同具有460 bp带型和322 bp带型的单株43个。其他编号的单株中均未同时检测出460 bp和322 bp带谱。证明这43个单株即为同时含有Pi1、Pi2基因（纯合体）单株。部分PCR扩增结果如图2、图3所示。
2.2 稻瘟病抗性表型鉴定
分子标记辅助选择获得聚合Pi1和Pi2基因BC3F3改良材料53份。对受体、供体亲本及改良株系苗期进行人工接种鉴定进行稻瘟病鉴定。调查结果表明，轮回亲本桂红一号自然状态下表现感病，抗病级别为9级；供体亲本BL122自然状态下表现抗病，抗病级别为1级；聚合了Pi1和Pi2基因的改良株系抗病效果明显，抗病级别为1～2级。成熟期在金秀县罗香乡调查叶瘟和穗颈瘟发病情况，调查结果表明，轮回亲本桂红一号自然状态下表现感病，抗病级别为8级，穗颈瘟严重；供体亲本BL122自然状态下表现抗病，抗病级别为1级；改良群体自然状态下抗病级别为1～4级，聚合了Pi1和Pi2基因的43株改良株系抗病级别为1～3级，其中29株表现高抗，抗病级别为1级。
对3份携带Pi1和Pi2基因的改良材料进行稻瘟病抗性鉴定，调查材料包含桂红一号、BL122和桂红一号/BL122，每份材料调查30株。调查结果发现，桂红一号表现为高感，抗病级别为8级；BL122表现为高抗，抗病级别为1级；携带有抗性基因的改良株系表现为中抗以上水平（表1）。
2.3 主要农艺性状评价
改良材料主要农艺性状（表2）与桂红一号相比，F5世代在株高和穗长等指标与桂红一号相比有显著差异，其余世代与桂红一号无明显差异；而所有世代在有效穗数指标方面与桂红一号相比有显著增加；所有世代在每穗总粒数、结实率、千粒重等指标方面与桂红一号相比无明显差异；所有世代在理论产量方面与桂红一号相比有明显增加。综合农艺性状分析显示，在导入Pi1和Pi2两个基因后，其后代的有效穗数和理论产量等农艺性状指标增加，而对其余农艺经济性状指标无显著影响。
3 讨论
采用水稻抗性种质资源或导入抗性基因[8，15]进行水稻抗性育种，是选育抗性水平较高的优质水稻新品种的重要途径之一。在实际育种中，如何在分离群体的大量个体植株中选择出目标单株是一项艰巨的工作，利用分子标记辅助的基因聚合方法培育多抗品种已经成为水稻分子育种的重要内容。随着水稻基因组测序的完成， 越來越多的重要基因被定位或克隆，分子标记辅助的基因聚合育种方法已经成为水稻分子育种的重要手段， 是现代分子生物学与传统遗传育种的结合点。在多基因聚合过程中，分子标记辅助选择具有非常高效的作用， 该技术能够快速准确地选到聚合2个或2个以上的目标基因的个体，克服了常规表型鉴定的局限性。倪大虎等[15]将抗稻瘟病基因Pi9（t）及抗白叶枯病Xa21和Xa23基因聚合到同一植株中，获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系；陈学伟等[16]利用农艺性状优良的G46B与地谷、BL-1、Pi4号3个分别含抗病基因Pi-d（t）1、Pi-b、Pi-ta2的稻瘟病材料进行聚合杂交， 并利用分子标记辅助选择在F2代及BC1代群体获得了含抗病基因的植株。本研究利用分子辅助标记方法将Pi1和Pi2两个广谱抗稻瘟病基因导入桂红一号中，人工接种鉴定表明改良株系后代抗稻瘟病级别为抗到高抗，自然病圃叶瘟和穗瘟的综合评价均达到抗和高抗水平。说明多个抗性基因聚合后，并不只是单个抗病基因抗谱之间的简单累加，而是表现出极显著的基因互作，使其能够抵抗单个抗病基因所不能抵抗的多种生理小种。因此聚合了Pi1和Pi2抗性基因的桂红一号改良材料可能会具有相对稳定的持久抗病特性。
随着科技发展和人民生活水平的日益提高，人民群众对稻米品质的要求越来越高，在外观品质和食味品质之外，更加注重稻米的营养和保健。中医认为红米能滋阴肾、健脾开胃，是延缓衰老的保健食品。红米富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸和人体必需的多种维生素和微量元素。红米中富含的微量元素锌、铜、铁、硒、钼、钙、锰等含量比普通稻（白）米高0.5～3.0倍；红米还含有黄酮类化合物、生物碱、植物淄醇以及强心甙和β-胡萝卜素等药用成分。红米具有升高血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL）和提高机体抗氧化能力的作用[17]。近年来，桂红一号[18，19]、柳红占211[20]、柳红占214[21]等优良红色特种籼稻品种得到广西等地广大农户和居民的认可，种植面积正在逐步扩大。而在2014年以来， 由于稻瘟病在广西等地的大范围爆发，对这些品种的推广造成严重威胁。另一方面，目前在广西目前还缺乏高产、优质、抗病的优良红米品种。因此，选育同时具备抗稻瘟病优质红米品种，既能解决稻瘟病对当前水稻生产的严重威胁，又能满足人们对优质稻米日益增长的消费需求，是广西现代水稻育种的重要目标。本研究利用分子标记辅助技术将广谱抗稻瘟病基因Pi1和Pi2导入到桂红一号中，从而增强其稻瘟病抗性，并利用回交等技术，注重农艺性状的选择，使其遗传背景和农艺性状与桂红一号相似，并改良了部分性状，使其在稻瘟病抗性和农艺性状方面均有优良的表现，达到了改良桂红一号稻瘟病抗性的目的。
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