腐片镰刀菌醇提取物与苯并噻二唑诱导水稻对抗稻瘟病相关酶活性的比较

基础上进一步对比分析该次生代谢产物与化学农药对水稻稻瘟病防御酶系的作用效果。【拟解决的关键问题】于水稻3叶1心期进行微生物源农药（野生芦苇内生真菌Fusarium solani醇提取物，WS）和化学农药苯并噻二唑（BTH）诱抗处理，以喷洒蒸馏水为对照，采用外接稻瘟病病菌法测定相关抗性酶系活性及植株抗病性，对比微生物源和化学农药对水稻稻瘟病相关抗性酶系活性的影响，为研发安全、绿色的生物农药提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试水稻品种为辽星1号；病原菌为稻瘟病生理小种703，由沈阳农业大学生物技术研究室提供；供试菌株为Fusarium solani，由辽宁省农业科学院微生物工程中心保存；供试农药为BTH（先正达公司研发，诺华公司用欧洲商标BION或美国商标Actigard生产）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 病菌孢子悬浮液的制备 稻瘟病菌703接种在番茄燕麦培养基上，28 ℃培养15 d，菌丝长满全皿时用棉签刮去菌丝，将培养皿放在湿润处，2 d后收集孢子，并制备成浓度为1.0×105个/mL（徐沛东等，2014）的孢子悬浮液备用。

1. 2. 2 次生代谢产物（WS）—菌丝醇提取物的制备 WS为野生芦苇内生真菌Fusarium solani的菌丝醇提取物，参照陈珣等（2012）的方法进行提取，使用浓度为50 ng/mL（肖军等，2015）。

1. 2. 3 抗病诱导水稻幼苗 将水稻种子用0.1%HgCl消毒15 min后于28 ℃浸种，催芽4 d，播种在塑料盆内（100株/盆），共播种4盆，在25 ℃的植物生长箱内培养。稻苗长至3叶1心时，1盆水稻幼苗喷洒50 mL的WS（50 ng/mL，含0.1%吐温-20），1盆喷洒50 mL的 BTH（136 μg/mL，含0.1%吐温-20），另外2盆各喷洒50 mL蒸馏水（含0.1%吐温-20）作为空白对照（CK1）和阳性对照（CK2）。诱导处理3 d后，喷雾接种稻瘟病菌分生孢子（CK1不接种），按葛秀春等（2002）的方法保温保湿培养。分别于接种稻瘟病菌0、3、6和9 d后取样测定水稻幼苗抗病相关酶系活性，每个指标称取叶片0.4 g左右（4片叶片），3次重复。

1. 3 测定项目及方法

1. 3. 1 抗病相关酶系活性测定 PAL、PPO活性参照徐沛东等（2014）的方法测定；CAD活性参照葛秀春等（2002）的方法测定；POD活性参照张穗等（2003）的方法测定；过氧化氢酶（CAT）活性参照唐勇军等（2011）的方法测定。

1. 3. 2 诱导水稻抗稻瘟病效果检测 水稻幼苗培养和接种方法同1.2.3，接种8 d后调查每片叶片的发病情况，按照GB/T 15790-2009记录发病级数、总株数和发病指数，计算病情指数。

1. 4 统计分析

利用Excel 2010对不同处理条件下抗性酶系变化趋势进行分析，采用SPSS 13.0对抗稻瘟病效果进行多重比较。

2 结果与分析

2. 1 不同处理对水稻叶片PAL活性的影响

由图1可以看出，在水稻3叶1心期（0 d），不同处理间叶片PAL活性基本稳定，为74.17～75.59 U/g·min。接种稻瘟病菌孢子后3 d，WS和CK2处理的叶片PAL活性明显降低，分别比0 d时降低10.87%和15.84%；而BTH和CK1处理的叶片PAL活性无明显变化。随着接种时间的延长，WS处理的叶片PAL活性有所回升，BTH处理的叶片PAL活性略有降低，CK2处理的叶片PAL活性持续降低，CK1处理的叶片PAL活性先降低后升高。接种后6～9 d，4个处理的叶片PAL活性表现为BTH>CK1>WS>CK2。表明诱抗剂对接种后的水稻叶片PAL活性具有明显的系统诱导作用，且BTH的诱导效果优于WS。

2. 2 不同处理对水稻叶片POD活性的影响

由图2可以看出，接种稻瘟病菌孢子后3 d，WS、BTH和CK2处理的水稻叶片POD活性均明显升高，分别比0 d时升高174.85%、95.41%和72.61%，CK1处理的POD活性变化不明显。随着接种时间的延长，WS处理的叶片POD活性先降低后升高，其他处理则持续升高，至第9 d时，WS和BTH处理的叶片POD活性分别为78.16和79.16 U/g·min，均高于CK1和CK2处理。表明使用诱抗剂，尤其是WS可使水稻幼苗在受到稻瘟病菌侵染初期時的POD活性迅速增加，在一定程度上使叶片抗逆反应提前，有助于保护植物免受病原菌进一步侵染，虽然CK2处理的活性也有所升高，但其增幅明显低于诱抗处理。

2. 3 不同处理对水稻叶片CAD活性的影响

接种稻瘟病菌孢子后0～9 d，4个处理的水稻叶片CAD活性无明显变化，分别为1.90～1.96、1.96～2.14、1.95～2.02和1.93～2.08 U/g·min。说明诱抗处理对水稻叶片的CAD活性影响不明显。

2. 4 不同处理对水稻叶片PPO活性的影响

由图3可以看出，接种稻瘟病菌孢子后3 d，WS、BTH和CK2处理的水稻叶片PPO活性均明显升高，分别为45.42、39.68和42.62 U/g·min，CK1处理的PPO活性变化不明显。随着接种时间的延长，WS、CK1和CK2处理的PPO活性持续上升，BTH处理的PPO活性先升高后降低，至接种后9 d，WS处理的POD活性最高，为58.67 U/g·min，BTH处理的PPO活性最低，为34.01 U/g·min。表明WS处理使水稻叶片受到病原菌侵染时PPO活性持续增加，BTH处理虽在前期也能促使水稻叶片PPO活性增加，但后期PPO活性下降较快，诱抗效果不及WS。

2. 5 不同处理对水稻叶片CAT活性的影响

由图4可以看出，接种后3 d，CK2处理的水稻叶片CAT活性大幅降低，随着自身防御机制的逐渐启动，CAT活性逐渐升高，第6 d时达到峰值，第9 d时略有下降，但仍高于其他处理。接种后0～6 d时，WS和BTH处理的CAT活性均呈先升高后降低的变化趋势，且BTH处理的活性均高于WS处理；但至第9 d时，BTH处理后的CAT活性大幅度降低，降至126.72 U/g·min，在4个处理中活性最低，而WS处理的CAT活性仍持续升高，为153.91 U/g·min，表明WS的诱导持久性优于BTH。同时可以看出，在受到病原菌侵染初期，诱抗剂有助于提高水稻叶片的CAT活性，使植物免受病原菌的侵染，但随着侵染时间的延长，诱抗剂提高CAT活性的能力弱于植物自身的防御功能。

2. 6 不同接种处理诱导水稻抗稻瘟病效果的比较

分别以WS、BTH和H2O（CK）进行诱导水稻抗稻瘟病试验，由表1结果可知，WS和BTH诱导处理后，水稻病株率、病斑数及病情指数均降低，其中WS处理的发病情况极显著低于CK（P<0.01），诱抗效果达56.21%，比BTH处理高14.78%（绝对值）。

3 讨论

坏死型病原菌侵染常能引起植物随后抗病性的系统性诱导，被称为系统获得抗性（Systemic acquired resintance，SAR）（Ryals et al.，1996）。近年来，有研究证明BTH可诱导多种植物产生系统抗性，如水稻抗稻瘟病（葛秀春等，2002）、番茄抗灰霉病（Azami-Sardooei et al.，2013）、辣椒抗黄色叶病毒（Trejo-Saavedra et al.，2013）等。本研究通过比较已知能够诱导多种植物产生SAR的化学诱抗剂BTH和自主分离的Fusarium solani次生代谢产物WS对水稻抗稻瘟病酶系的影响，结果表明，BTH和WS在不同程度上对水稻抗病酶系的活性均有促进作用，均通过提高酶类活性而提高水稻抗病性，但其作用效果不同，在稻瘟病菌胁迫下，BTH对PAL活性的提高优于WS，WS前期对POD活性的提高优于BTH，两者前期对PPO和CAT活性的影响趋势基本相同，但BTH的持续性不佳。WS和BTH在水稻抗稻瘟病作用上均有一定效果，但WS的诱抗效果优于BTH。同时，在水稻接种培养阶段，观察到喷施BTH的水稻苗的生长速度低于其他处理，因此该化学诱抗剂可能不适合在苗期使用。WS为微生物源诱抗剂，属生物农药，可最大程度地降低化学农药的使用，减轻环境污染。

有研究表明，SAR表现过程中激发植物防卫基因表达及反应机制启动，其中编码PAL的基因是一个很重要的防卫基因（迟莉，2014）。植物遭遇病原物侵染时会合成许多新的物质， 包括植保素、木质素、酚类化合物及病程相关蛋白等， 这些物质大多需要通过苯丙烷类代谢途径合成，而PAL是苯丙烷类代谢途径的限速酶。黎军英等（2004）研究表明，通过使水稻植株PAL基因表达量提高、PAL活性升高，可达到水稻抗稻瘟病的目的，与本研究中使用WS和BTH诱导后，水稻叶片PAL活性升高，有助于PAL基因的表达，促进系统获得抗性建立的结果一致。另一方面，防御反应机制主要涉及细胞壁木质化，POD和CAD均是植物体内重要的防御类氧化酶，也是木质素合成的关键酶。本研究结果表明，诱抗剂可提高水稻叶片POD活性，使其参与防御反应机制，但CAD活性几乎没有变化。这与葛秀春等（2002）研究发现BTH可使水稻叶片CAD活性在接种后2 d内显著增高的结果不同，可能是由于本研究中所用诱抗剂的浓度较低，不足以激起CAT活性变化。

PPO是一种含铜的氧化酶，在植物体内催化各种酶类物质氧化形成相应的醌和木质素前体。CAT是清除H2O2的主要酶类，与POD协作清除体内的超氧自由基。本研究结果表明，WS和BTH处理均可使水稻叶片PPO和CAT活性升高，有助于植物产生抗病性，且PPO的变化趋势与Zhong等（2010）研究表明接种稻瘟病菌24 h后，药剂喷施处理PPO活性升高的趋势基本一致。本研究中，WS的持续性优于BTH，但两者提高CAT活性的能力弱于植物自身的防御功能。

本研究就诱抗剂对水稻稻瘟病抗性酶系的影响及病情指数进行了研究，今后尚需进一步研究微生物源诱抗剂WS抗稻瘟病的机理及其作为生物农药应用于田间试验时存在的剂型、合适剂量及稳定性等一系列问题。

4 结论

本研究结果表明，不同诱抗剂诱导水稻抗稻瘟病的效果存在差异，微生物源诱抗剂WS的作用效果整体上优于化学药剂BTH。

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（责任编辑 王 晖）

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