[摘要] 目的 探讨姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1表达、增殖和凋亡的影响。 方法 分离SD大鼠血管平滑肌细胞进行培养传代，采用不同浓度的姜黄素作用于氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）诱导的大鼠平滑肌细胞，根据作用药物浓度进行分组，对照组（不加任何药物），Ox-LDL 100 μg/mL组，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素 20 μmol/L组，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素 40 μmol/L组，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素80 μmol/L组。分析姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达、对细胞的增殖的影响。按照加入药物浓度进行分组，对照组（不加任何药物），姜黄素50 μmol/L组，姜黄素100 μmol/L组，姜黄素120 μmol/L组，分析姜黄素对细胞凋亡的影响。 结果 Ox-LDL 100 μg/mL组MCP-1分泌[（812.6±78.7）ng/L]及MCP-1 mRNA表达水平[（1.18±0.11）]较对照组[（91.3±6.1）ng/L，（0.16±0.04）]显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。姜黄素对Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表达、细胞增殖具有显著的抑制作用，对细胞凋亡有诱导作用，并且随着姜黄素浓度的增加，作用越明显（P < 0.01）。 结论 姜黄素能够抑制Ox-LDL诱导的大鼠细胞平滑肌细胞MCP-1表达以及细胞增殖，诱导大鼠细胞平滑肌细胞凋亡。
[关键词] 姜黄素；大鼠；血管平滑肌细胞；单核细胞趋化蛋白-1
[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（c）-0008-05
冠心病是临床常见病，近年来，随着人们饮食结构的变化以及生活工作节奏的增快，冠心病的发生率呈上升趋势。动脉粥样硬化是冠心病的病理基础，而平滑肌增生、迁移参与了冠状动脉粥样硬化的整个过程。氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）能够促进动脉粥样硬化的发生和发展[1-2]。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）具有活化和趋化单核/巨噬细胞的作用，单核细胞在MCP-1的趋化作用下，聚集在血管内膜下，吞噬脂质、形成泡沫细胞[3-4]。姜黄素是一种从姜黄、莪术等植物中提取的成分，具有抗炎、抗氧化、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等作用[5]。本研究分析姜黄素对Ox-LDL诱导大鼠平滑肌细胞MCP-1的表达情况以及平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。现将结果报道如下：
1 材料与方法
1.1 一般材料
1.1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠，体重250～300 g，周龄2～5周，购于常州卡文斯实验动物有限公司。
1.1.2 主要试剂和仪器 姜黄素（长沙华锦生物科技有限公司），大鼠MCP-1 ELISA试剂盒（上海凯博生化试剂有限公司），Western-blot化学发光试剂盒（贝博生物），总DNA提取盒（广州健仑生物科技有限公司），逆转录试剂盒（广州健仑生物科技有限公司），PCR扩增试剂盒（上海生工生物科技有限公司）。二氧化碳培养箱（无锡精创科技有限公司），凝胶成像分析系统（法国Vilber），低温冷冻高速离心机（德国Hettich），蛋白电泳仪（日本ATTO株式会社公司），基因扩增仪（上海西朴生物科技有限公司），多功能酶标仪（美国BioTek公司）。
1.1.3 主要试剂配制 姜黄素溶液：姜黄素粉末溶于二甲基桠枫，配成的原液浓度为50 mmol/L，低温保存，需要时配制成需要的浓度。PBS平衡盐溶液配制：8 g氯化钠，0.2 g氯化钾，磷酸氢钠2.9 g，磷酸氢钾0.2 g加蒸馏水，陪成1 L，调整pH值7.3～7.5，分装，低温保存。培养基：DMEM干粉加去离子水溶解，定容1000 mL，加双抗，调节pH为7.0，过滤除菌后分装，4℃保存。MTT（噻唑蓝）工作液：MTT溶于PBS液中，配制浓度为5 mg/mL，过滤除菌，4℃保存。
1.2 研究方法
1.2.1 大鼠原代主动脉平滑肌细胞培养传代 SD大鼠处死后分离大鼠主动脉，在青霉素无血清DMEM中漂洗3～4次，分离中膜层，DMEM培养基清洗3次，放入培养皿，加胎牛血清。剪碎中膜层，放入培养瓶中，加入含20%胎牛血清的DMEM培养基，翻转培养瓶，使组织块贴壁，放入培养箱中，37℃，5%CO2，培养3h。翻转培养瓶，次日观察无污染，继续培养5～7天，见原代血管平滑肌细胞。当细胞覆盖率达到80%～90%，细胞单层融合，进行消化传代。每2天换1次液。传至2～3代冻存。
1.2.2 姜黄素对Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）MCP-1分泌的影响研究方法 取出平滑肌细胞进行解冻、培养并传代，取传3～8代细胞，通过免疫组化法鉴定为血管平滑肌细胞用于实验。根据作用药物及浓度不同进行分组。对照组（不加任何药物），Ox-LDL 100 μg/mL组，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素5 μmol/L组，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素10 μmol/L组，Ox-LDL 100μg/mL+姜黄素30 μmol/L组。采用ELISA和RT-PCR检测细胞上清中MCP-1的浓度以及细胞MCP-1 mRNA的表达情况。
1.2.3 姜黄素对Ox-LDL诱导大鼠VSMCs增殖的影响研究方法 冻存细胞解冻，培养，传代，鉴定为平滑肌细胞。根据作用药物浓度进行分组，对照组（不加任何药物），Ox-LDL 100 μg/mL组，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素20 μmol/L组，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素40 μmol/L组，Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素80 μmol/L组。采用MTT法检测OD值测定细胞增殖程度。
1.2.4 姜黄素对VSMCs诱导凋亡作用的研究方法 取冻存细胞解冻，培养传代，鉴定为平滑肌细胞。按照加入药物浓度进行分组，对照组（不加任何药物）姜黄素50 μmol/L组，姜黄素100 μmol/L组，姜黄素120 μmol/L组，检测细胞凋亡情况，采用Western-blot方法检测细胞caspase-8p10表达水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 15.0统计学软件数据处理，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 姜黄素对Ox-LDL诱导VSMCs MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表达的影响
Ox-LDL 100 μg/mL组MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表达水平较对照组显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素10 μmol/L组和Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素30 μmol/L组MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表达水平较Ox-LDL 100 μg/mL组显著下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素 30 μmol/L组MCP-1分泌水平又显著低于Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素5 μmol/L组和Ox-LDL 100μg/mL+姜黄素10 μmol/L组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。
2.2 姜黄素对Ox-LDL诱导的VSMCs增殖影响
对照组OD值为（0.326±0.039），见图1。Ox-LDL 100 μg/mL组OD值为（0.548±0.074），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素20 μmol/L组OD值为（0.522±0.072），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素40 μmol/L组OD值为（0.442±0.061），Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素80 μmol/L组OD值为（0.379±0.066）。各组之间比较，差异有高度统计学意义（F = 12.977，P < 0.01）。其中Ox-LDL 100 μg/mL组OD值显著高于对照组，而Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素40 μmol/L组OD值和Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素80 μmol/L组OD值较Ox-LDL 100 μg/mL组OD值显著下降，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。
A组：Ox-LDL 100 μg/mL组；B组：Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素20 μmol/L 组；C组为Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素 40 μmol/ L 组；D组：Ox-LDL 100 μg/mL+姜黄素 80 μmol/ L 组；与对照组比较，*P < 0.01；与A组比较，△P < 0.01；Ox-LDL：氧化型低密度脂蛋白
2.3 姜黄素对大鼠平滑肌细胞凋亡及caspase-8p10表达的影响
姜黄素50 μmol/L组、姜黄素100 μmol/L组、姜黄素120 μmol/L组大鼠平滑肌细胞凋亡率、caspase-8 p10表达较对照组显著升高，姜黄素100 μmol/L组和姜黄素120 μmol/L组显著高于姜黄素50 μmol/L组，而姜黄素120 μmol/L组又显著高于姜黄素100 μmol/L组，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。提示随着姜黄素浓度的升高，凋亡率及caspase-8p10表达升高越明显。
3 讨论
冠心病是中国首要的致死原因，由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致。冠状动脉粥样硬化，导致管腔狭窄、板块破裂是导致冠心病的病理基础。大量研究显示血管平滑肌在动脉粥样硬化的发生和发展中发挥了重要的作用。动脉粥样硬化的板块中存在来自血液的炎性细胞、免疫细胞、中性粒细胞，还包括来自血管壁的内皮细胞以及血管平滑肌细胞等[6]。血管内皮功能障碍，促进细胞和脂质的渗透，脂质蛋白氧化，血管平滑肌细胞增殖，血小板活化，血栓形成，导致粥样硬化的启动。细胞因子在动脉粥样硬化的发生和发展过程中也发挥重要的作用，TF是凝血级联反应中重要的启动子，TF抗原、TFmRNA存在于多种细胞中，包括血管平滑肌细胞、内皮细胞等[7]。环氧化酶-2在动脉粥样硬化组织中的表达显著升高，特别表达于炎性巨细胞以及中层VSMCs中[8]。
低密度脂蛋白胆固醇（LDL）是血浆胆固醇主要的转运体。Ox-LDL是氧化修饰的低密度脂蛋白，被认为是动脉粥样硬化关键的启动因素[9]。LDL中不饱和脂肪酸中的脂质分子被氧化，产生大量的脂质氧化物，脂质氧化产物共价修饰apoB蛋白，产生乙醛类复合物，这些乙醛类的复合物进一步氧化修饰脂蛋白氨基酸残基，生成各种加合物，最终形成Ox-LDL[10-11]。Ox-LDL是一类经化学修饰的脂蛋白颗粒的混合物，而不是单一成分。LDL氧化修饰机制包括金属离子氧化法，髓过氧化物酶氧化作用，糖化LDL，一氧化氮及其氧化机制。在动脉粥样硬化剂血管性疾病的发病机制中，Ox-LDL必不可少。Ox-LDL可引起细胞内皮细胞结构和功能的变化，从而导致内皮细胞变性、坏死、脱落，导致血管内皮完整性遭到破坏[12]。单核细胞以及LDL通过血管内皮进入内膜下，形成脂质条纹。Ox-LDL还能刺激单核细胞、内皮细胞、巨噬细胞等分泌大量的言行因子、黏附因子、趋化因子，促使单核细胞核内皮细胞分化为巨噬细胞。遗传性高脂血症兔模型血浆Ox-LDL水平显著升高，抗氧化剂能够降低Ox-LDL水平，减轻动脉粥样硬化的进程。心绞痛患者血液中Ox-LDL水平显著升高，外周血NF-κB活性升高，而在体外培养的单核细胞中加入Ox-LDL，能够显著增加NF-κB活性，这提示Ox-LDL能增加NF-κB活性，从而增加患者的氧化应激反应[13-14]。重组人IgG1抗体是针对Ox-LDL表位DNA修饰的apoB-100表位的抗体，研究证明其能显著降低小鼠血液中Ox-LDL水平，说明Ox-LDL抗体在降低血液中Ox-LDL水平，从而阻止动脉粥样硬化进程而发挥作用。
细胞趋化蛋白是一个蛋白质家族，由十余种结构有较大同源性、分子量多为8～10 kD的蛋白组成。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是β亚家族的代表，可趋化单核细胞。由内皮细胞、血管平滑肌细胞等产生。MCP-1提高VSMC中MCPIP1 mRNA水平，并呈剂量和时间依赖性地上调MCPIP1蛋白表达[15]。和MCP-1处理的VSMC相比，MCPIP1基因沉默后VSMC的细胞数量、细胞活力及细胞DNA合成率均明显降低，S期细胞数量下降；MCPIP1基因沉默可抑制MCP-1或PDGF对c-fos mRNA的上调作用。单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白通过介导单核细胞趋化蛋白-1诱导的血管平滑肌细胞的增殖[16]。MCP-1基因-2518A/G多态性与心肌梗死易感性具有密切的相关性[17]。
姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。姜黄为常用中药，其主要生物活性成分为姜黄素类和挥发油。前者具有降血脂、抗凝、抗氧化、利胆、抗癌等作用；而后者主要起抗炎、抗菌以及止咳作用[18-20]。姜黄素具有诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞生长等作用，从而发挥抗癌作用。姜黄素对心血管疾病、关节炎、关节肿大等也具有临床疗效[18-22]。姜黄素能够调节血脂水平，抑制细胞增殖，抗脂质过氧化，抑制脂质斑块的形成，抗炎、抗凝血，抑制心肌重构等。姜黄素能够抑制人冠状动脉内皮细胞膜表面血栓调节蛋白和内皮细胞活化蛋白的表达，还能够抑制TNF-α介导的人冠状动脉内皮细胞膜表面TM、EPCR mRNA的表达，从而达到抑制和减少血栓形成的作用。
既往研究显示Ox-LDL能够促进血管平滑肌细胞MCP-1的分泌而参与动脉粥样硬化的发生。在本研究中，Ox-LDL作用的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1的分泌显著增加，并且MCP mRNA的表达也显著增加，这与既往的研究结果一致。而姜黄素具有抑制Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1的分泌以及MCP mRNA的表达，并且这种抑制作用随着姜黄素弄高度的升高，作用越强。Ox-LDL能够显著诱导大鼠血管平滑肌细胞的增殖，而血管平滑肌细胞的增殖、迁徙与动脉粥样硬化的发生关系密切。在本次研究中，姜黄素对Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并且随着姜黄素弄得的升高，抑制作用越明显，说明这样的抑制作用具有浓度依赖性。平滑肌细胞凋亡不足时动脉粥样硬化早期进展的主要因素，因此诱导平滑肌细胞凋亡可能会成为防治动脉粥样硬化的方法之一。在本研究中，姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞具有显著的诱导凋亡作用，并且随着浓度的升高，这样的诱导作用也逐渐增强，说明姜黄素诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡具有浓度依赖性。Caspase-8是凋亡的启示因子，能够启动细胞凋亡的细胞外途径和细胞内途径。在本研究中，姜黄素能够显著上调Caspase-8的表达，这可能是其诱导细胞凋亡的主要机制。
综上所述，Ox-LDL能够上调大鼠血管平滑肌细胞MCP-1的表达以及MCP mRNA的表达，诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖，姜黄素对Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1、MCP mRNA的表达，以及细胞增殖具有抑制作用，且能诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡。
[参考文献]
[1] 周礼圆，蓝娇，李燕华，等.急性脑梗死患者血清脂联素、过氧化物酶体增殖物活化受体γ、氧化型低密度脂蛋白及单核细胞CD36、CD54表达的关系[J].河北医科大学学报，2013，34（11）：1368-1371.
[2] 冉小丽，吴芹，石京山，等.凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1在动脉粥样硬化中的作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2013，27（5）：865-871.
[3] 陈福生，罗莘，欧阳淑其.缬沙坦对冠状动脉介入术后血清单核细胞趋化蛋白-1和单核细胞受体γ的影响[J].中华临床医师杂志：电子版，2013，7（18）：42-46.
[4] 王美宁，何海宁，黄勇奇，等.血清单核细胞趋化蛋白-1水平与新诊断2型糖尿病和糖耐量减低的相关性研究[J].中国糖尿病杂志，2013，21（12）：1057-1059.
[5] 林中民，焦立卓，郑怡，等.姜黄素衍生物B06对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用及其机制探讨[J].中国应用生理学杂志，2014，30（1）：38-42.
[6] Hansson GK. Inflammation，atherosclerosis，and coronary ar tery disease [J]. N Engl J Med，2005，352（16）：1685-1695.
[7] 潘俊杰，罗心平.组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用[J].复旦学报：医学版，2013，40（5）：606-609，624.
[8] Ziad AM，Suzanne KS. Cyclooxygenase-2 and atherosclerosis：friend or foe [J]. Neph Dial Tran，2001，16：2286-2288.
[9] Nagase M，Abe J，Takahashi K，et al. Genomic organization and regulation of expression of the lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor（LOX-1） gene [J]. J Biol Chem，1998，273（50）：33702-33707.
[10] 高素玲，甄志刚，张江，等.糖尿病并脑梗死患者氧化型低密度脂蛋白检测及临床意义[J].中国实用神经疾病杂志，2013，16（21）：36-37.
[11] 付文波，李斌，龚志刚，等.氧化低密度脂蛋白致损人单核细胞白血病细胞株源性巨噬细胞Notch信号的表达[J].中国心脏起搏与心电生理杂志，2013，27（5）：427-430.
[12] Shih HH，Zhang S，Cao W，et al. CRP is a novel ligand for the oxidized LDL receptor LOX-1 [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296（5）：1643-1650.
[13] 彭扬，白雪，张毅，等.辛伐他汀对氧化型低密度脂蛋白及葡萄糖诱导的LOX-1表达的不同作用[J].天津医药，2013，41（11）：1059-1062.
[14] Chen XP，Du GH. Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1：protein，ligands， expression and pathophysiological significance [J]. Chin Med J（Engl），2007，120（5）：421-426.
[15] Watanabe T，Pakala R，Katagiri T，et al. Monocyte chemotactic protein-1 amplifies serotonin-induced vascular smooth muscle cell proliferation [J]. J Vasc Res，2001，38（4）：341-349.
[16] 杨一峻，吴柳松，束波，等.MCPIP1介导MCP-1诱导的血管平滑肌细胞增殖[J].生理学报，2013，65（6）：616-622.
[17] 孙继红，陈博，佟明.MCP-1基因-2518A/G多态性与心肌梗死易感性关联的Meta分析[J].山东医药，2013，53（47）：61-64.
[18] 李勇，肖雅玲，陈朝晖，等.姜黄素对人肝母细胞瘤细胞株HepG2增殖和转移的影响[J].中国普通外科杂志，2014，23（1）：117-120.
[19] 罗苏明，韩振魁，斯坎德尔·努尔买买提，等.姜黄素体外抑制人结肠癌癌细胞Caco-2增殖[J].临床和实验医学杂志，2013，12（7）：493-494，497.
[20] 熊二梦，龚爱华，金洁，等.姜黄素联合顺铂对人肝癌细胞HepG2增殖、自噬和凋亡的影响[J].江苏医药，2014，40（1）：1-4.
[21] 屈云飞，罗淑娟，令狐华，等.姜黄素对大鼠子宫内膜异位病灶的抑制作用及其对雌激素水平的影响[J].西部医学，2012，24（5）：836-840.
[22] 文秀芳，陈霞，邬海桥.姜黄素通过抑制TLR4信号通路下调脂多糖诱导的肺巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-8[J].云南中医学院学报，2013，36（6）：22-25.
（收稿日期：2014-03-31 本文编辑：苏 畅）