【摘 要】目的：探讨Smac在食管癌组织中的表达及其与Caspase-3之间的关系。方法：采用免疫组织化学S-P法检测Smac和Caspase-3在食管癌组织和癌旁正常食管组织中的表达情况。结果：Smac在食管癌旁正常食管组织中的表达明显高于癌组织 （ P <0. 05） 。Smac表达与癌组织分化程度无关（ P > 0.05） 。Caspase-3在癌旁正常食管组织中表达明显高于癌组织 （ P < 0. 05） 。在食管癌组织Smac与Caspase-3表达呈正相关（ P <0. 05）。结论：Smac在食管癌组织中异常表达，有望成为食管癌诊断和基因治疗的新靶点。Smac基因与凋亡相关基因Caspase-3的异常表达可能在食管癌癌变中起协调作用。
【关键词】凋亡抑制蛋白；Smac；食管癌；Caspase-3；免疫组化
【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0220-02
Smac（Second mitochondria-derived activator of caspase）是新近发现的促凋亡因子，它的作用是去除凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein， IAP）家族对Caspase的抑制作用，从而诱发凋亡。Smac在人的睾丸中表达最高，在心脏、肝、肾、脾、前列腺、卵巢中次之，脑、肺、胸腺和外周血淋巴细胞表达低（1），在正常细胞不诱发凋亡，只在受损的细胞中起作用（2），提示了在肿瘤的发生与发展中该基因起到了重要作用。在细胞凋亡中Caspase家族起了重要作用，而Caspase-3被认为是哺乳动物细胞凋亡过程中关键的蛋白酶。食管癌是常见的恶性肿瘤之一，研究表明与凋亡相关的多种基因参与食管癌的发生、发展，但很少有关于Smac与Caspase-3蛋白在食管癌中的表达及二者相关性的研究。本试验分别测定Smac蛋白和Caspase-3蛋白在食管癌组织和癌旁正常组织中的表达，进一步探讨二者在食管癌发生、发展中的关系，以期为临床实际工作有一定的指导作用。
1 材料与方法
1.1 临床资料
40 例食管鳞癌标本及20例部分相应的癌旁正常食管组织标本取材于郑州大学第一附属医院胸外科2004 年1月至2007年12月手术切除标本，均有病理证实，其中男：35例，女：5例，年龄38岁～66 岁（平均51. 9岁）。40例肿瘤组织中，8例低分化，12 例中分化，20 例高分化。术前患者均未行放、化疗，标本经10%福尔马林固定后常规石蜡包埋，制备切片厚4µm。
1.2 方法
兔抗人Smac、兔抗人Caspase-3多克隆浓缩型抗体均为美国SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC公司产品，抗体工作浓度为1： 100 。DAB 显色剂及通用型PV9000超敏试剂盒均为北京中山生物技术开发有限公司生产。免疫组织化学染色采用S-P法，具体步骤参考说明书进行，以PBS 缓冲液替代第一抗体作为空白对照，用已知阳性片作阳性对照。
1.3 结果判定
组织切片染色以胞浆中染成淡黄或棕黄色为阳性，每张切片随机选取10个高倍视野，每个高倍视野计数100 个细胞，根据阳性细胞百分数分为：阳性细胞数< 5%为阴性，10%～30%为弱阳性，>30%为强阳性。
1.4 统计学处理
显著性用χ2检验，相关性用Spearman检验。
2 结果
2.1 Caspase-3在食管癌组织、癌旁正常食管组织的表达情况（见表1、图3）。
40例食管癌组织中有21例Caspase-3蛋白表达（阳性率为52.5% ），而20例癌旁正常组织中有17例Caspase-3蛋白表达（阳性率为85.0% ），两者之间有显著性差异（χ2 =6.06， P < 0. 05） 。
2. 2 Smac 在食管癌组织、癌旁正常食管组织中的表达情况（见表2、图1、图2）。
40例食管癌组织中有23 例Smac蛋白表达（阳性率为57.5% ），20 例癌旁正常组织有18例Smac蛋白表达（阳性率为90.0% ），两者之间有显著性差异（ P < 0. 05） 。在食管癌组织中，Smac的表达与癌组织分化程度无关（ P > 0. 05） 。
2.3 食管癌组织中Smac 和Caspase-3表达的相关性
23例Smac蛋白表达阳性的食管癌组织中有16例Caspase-3蛋白表达，17例Smac蛋白表达阴性的食管癌组织中有5例Caspase-3蛋白表达，Smac蛋白表达与Caspase-3蛋白表达呈正相关（r =0. 477，χ2 =6.32， P <0. 05） 。
3 讨论
在肿瘤的发生、发展中，细胞凋亡起着重要作用，Caspase蛋白酶家族（即含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶）是细胞凋亡的中心环节（3，4）。不同的凋亡途径最终都需激活的Caspase参与，凋亡刺激（如血清丢失、细胞表面受体激活或DNA的破坏）引起线粒体膜通透性变化，释放胞色素c，进而依次激活始动Caspase（Caspase-2，-8，-10）和效应Caspase（Caspase-3，-6，-7），引起凋亡（1，5）。Caspase主要是通过与IAPs 的结合导致Caspase活性的丧失，从而抑制细胞凋亡发生。
Smac是细胞受到凋亡刺激时，由线粒体释放入胞浆的蛋白，Smac能消除IAPs对Caspase的抑制，且能激活Caspase的酶原和增强成熟Caspase的酶活性的双重功效（6），另外Smac可与已发现的所有IAPs结合，使IAPs丧失抑制Caspase活性的作用，因此Smac在细胞凋亡的共同途径中占有极重要的作用。Yoo等（7）用免疫组化分析Smac的表达，结果显示癌瘤中表达率为62%，在肉瘤中表达率为22%。表明Smac在不同癌组织中的表达是不同的，提示低表达时可能抑制凋亡。
本研究提示Caspase-3在癌旁正常组织中的阳性表达率与食管癌组织中的阳性表达率比较有显著差异（ P < 0. 05），同文献报道Caspase-3在胃肠道肿瘤中的表达特点一致（8，9 ）。Smac在癌旁正常组织中的阳性表达率明显高于在食管癌组织中的阳性表达率（ P < 0. 05） ，提示Smac的异常表达与食管癌的发生有密切关系，但Smac的表达与癌组织分化程度无关。
肿瘤的发生是一个多步骤的发展过程，是多因素参与、多基因互相作用的结果。本研究发现：食管癌中Smac与Caspase-3的表达呈正相关， Smac阳性表达组的Caspase-3表达率较Smac阴性表达组高，这一结果提示Smac对Caspase-3表达可能是正反馈调节，Smac表达减少直接或间接引起Caspase-3的表达下降，减少细胞凋亡，从而促进肿瘤的发生、发展及恶性增殖，二者关系可能是食道癌细胞凋亡信号传导网络中的重要一环。
Smac在癌组织中的表达及其诱导凋亡的作用已引起广泛关注，目前仍有许多问题有待探讨，但相信随着更深入的研究，Smac有望成为食管癌诊断和基因治疗的新靶点，为食管癌的诊断治疗带来新途径。
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