摘 要：为探讨杏花粉种质保存的方法，进而为花粉培养、遗传转化和杂交育种提供材料，以杏品种金太阳的新鲜成熟花粉为试材，采用干燥法和玻璃化法2种超低温保存技术，对花粉干燥时间、解冻方式和贮藏时间等影响保存后花粉萌发率的有关因素进行研究。结果表明，干燥时间对金太阳杏花粉超低温保存后的萌发率有显著影响，其中干燥法宜在4 ℃下硅胶干燥8 h、玻璃化法宜在(20±1)℃下以玻璃化液PVS2(体积分数15％二甲基亚枫+15％乙二醇+30％甘油+0.4 mol/L蔗糖)处理60 min；干燥法保存后分别以4℃2 h、20℃30 min和40℃70 s等3种方式化冻．花粉萌发率无明显差别，而对玻璃化法则以40℃70 s化冻后的花粉萌发率最高；以2种方法分别保存1、lO、30、60d后花粉萌发率无显著变化。
关键词：杏；花粉；干燥法；玻璃化法；超低温保存
中图分类号：$662．2 文献标识码：A
文章编号：1009-9980(2007)05-689-03
超低温保存技术是目前长期稳定保存植物种质资源较为理想的方法，它是指在超低温(通常是指液氮温度，-196℃)条件下，细胞的全部代谢活动近于完全停止，因而可以保持种质的遗传稳定性，达到长期稳定保存的目的。自1973年Nag等首次在液氮中成功保存胡萝卜悬浮细胞以来，植物种质资源超低温保存技术已在许多植物材料如原生质体、愈伤组织、体细胞胚、茎尖分生组织、芽、花粉等组织和器官保存试验中取得成功。花粉具有体积小、携带方便的特点，成熟花粉包含着植物的遗传信息，随着花粉单倍体育种、花粉遗传转化等工作的开展，对花粉保存的研究愈加受到重视。目前已有柿、枇杷等超过10种果树花粉应用超低温保存技术取得成功，但对杏花粉用玻璃化法进行超低温保存的研究尚未见报道。试验以杏品种金太阳花粉为材料进行超低温保存研究，以期能为杏花粉的种质保存、进而为花粉培养、遗传转化和杂交育种研究提供参考。
1 材料和方法
1．1 材料
试验于2006年在河南农业大学园艺植物实验室进行。材料为河南农业大学科教园区种植的4 a生杏品种金太阳(Prunus armeniaca Linn．cv．Sun—gold)，3月中旬在晴天上午采集生长健壮的植株的含苞待放的花蕾，带回室内用镊子摘除花药，平摊于硫酸纸上，室温下自然晾干20 h，收集散出的花粉．双层塑料薄膜包裹，置于4℃冷藏箱中贮藏备用。
1．2 方法
1．2．1 干燥法保存步骤于4 cC条件下，将花粉等量放入2 mL冻存管内(每管装载容积的1/3)，敞开管口垂直放于干燥器内，以硅胶(4 L干燥器中加入l kg硅胶)干燥不同时间(0、2、4、6、8、12、16 h)后，取出冻存管将不同处理时问的花粉分为2部分，一部分加上冻存管盖后投入液氮(-196 ℃)中，保存不同时间(1、10、30、60 d)后取出，用不同温度和不同时间(4℃2 h、20℃ 30 min、40℃70 s)解冻后，分别检测花粉萌发率，以另一部分不经液氮保存的花粉为对照。
1．2．2玻璃化法保存步骤 于室温(20℃)条件下，将花粉等量放入2 mL冻存管中，以植物玻璃化液PVS22体积分数15％二甲基亚枫+15％乙二醇+30％甘油+0.4mol/L蔗糖)处理不同时间(0、10、20、40、60、80、100 min)后，一部分迅速投入液氮(-196℃)中，保存(不同时间设置同1．2．1)后取出解冻(方法同1．2．1)后，以1.0 mol/L蔗糖液洗涤2次，每次8 min，分别检测花粉的萌发率，以另一部分不经液氮保存的花粉为对照。
1．2. 3花粉萌发率的检测方法采用糖液发芽法，将干燥法保存过的花粉在室温和100％相对湿度下复水30 min，玻璃化法保存过的花粉用蒸馏水洗去表面糖液后，均匀散播于萌发培养基(体积分数15％蔗糖+1％琼脂)，培养温度为(25±0.5)℃，培养2.5 h后在显微镜下观察花粉萌发状况，统计花粉萌发率(以花粉管长度大于花粉粒直径为存活标准)。试验采用完全随机设计，3次重复，调查花粉萌发率时每小区测定花粉量100粒。
2 结果与分析
2．1 干燥时间对用2种超低温保存方法保存花粉萌发率的影响
用干燥法对金太阳杏花粉超低温保存的结果从表1中可以看出，随硅胶干燥处理时间的延长，未经液氮保存的花粉萌发率逐渐降低，而经液氮保存的花粉生活力则先升高又降低，其中干燥时间为8 h时，萌芽率最高为72.4％，显著高于其它处理。原因可能为，未经液氮保存的花粉，随干燥处理时间的延长，含水量迅速降低，花粉的萌发率也随之下降，而经液氮保存的花粉，当干燥一定时间，到达花粉适合含水量后，萌发率最高。因此金太阳杏花粉适宜的干燥脱水时间应控制在8 h左右。
经玻璃化法处理保存的杏花粉随处理时间的延长，未经液氮保存的花粉萌发率逐渐降低，而经液氮保存的花粉生活力则先降低又升高，随之又降低，其中处理时间为60 min时，萌芽率最高，达到70．2％。无论是对照或处理，用保存剂PVS2处理后，花粉的萌发率有明显下降趋势，在处理时间长于60 min后。花粉的萌发率愈加降低(表2)。说明该花粉对保存剂的毒害作用反应敏感。因而金太阳杏花粉适宜的玻璃化液处理时间应为室温下60 min。
图1所示。保存方法不同，金太阳杏花粉超低温保存后要求的解冻方法也不同。低温4℃ 2 h、室温20℃30 min和高温40℃70 s化冻后，干燥法超低温保存后的花粉萌发率均可超过70％：而玻璃化法超低温保存后的花粉则对解冻温度和时间比较敏感，其中以40 ℃解冻70 s时的萌发效果最好，室温次之，低温4℃时效果最差。化冻方式是超低温保存研究中的关键步骤，不同植物材料超低温保存后最佳化冻方式不同。因此40℃解冻70 s的解冻方式对金太阳杏花粉玻璃化法保存来说是适宜的，而对干燥法来说上述3种化冻方式无明显差别。
2．3保存时间对2种超低温保存方法花粉萌发率的影响
从表3可以看出，金太阳杏花粉在液氮(-196℃)超低温条件下保存不同时间，萌发率没有显著变化，说明该保存方法对长时间保存杏花粉是比较适宜的。
3 讨论
1)干燥法超低温保存花粉已在多数植物花粉上试验成功，但是应用玻璃化超低温保存花粉的研究还比较少，保存剂成分和处理时间仍存在不确定性，同时超低温保存技术在我国实际生产上的应用还近于空白。以杏为材料。结合前人在其它果树上已取得的试验成果，力求进一步扩大超低温保存技术的应用范围。从我们的试验结果来看，玻璃化法和干燥法这2种保存方法对金太阳杏花粉来说，都是比较适宜的。因此应用玻璃化法超低温保存植物花粉材料具有一定的实际应用价值。
2)应用玻璃化法超低温保存花粉时，不同处理时间花粉的萌发率呈现出先降低后升高，又下降的变化趋势。原因可能是保护剂处理时间过短。材料脱水不够。在降温过程中不能迅速达到玻璃化状态。因而降低了花粉的萌发率。处理时间过，长花粉由于受到玻璃化液的毒害，萌发率反而又有所降低。
3)试验结果表明，在投入液氮或解冻过程中，高含水量的花粉细胞内容易过多结冰，造成冰冻伤害，影响保存后的活力，但干燥时间或玻璃化液处理时间太长，花粉含水量太少(生理缺水)也会影响保存后的活力。所以含水量是影响花粉超低温保存效果至关重要的因素。
4)前人研究表明：用玻璃化法保存的花粉经液氮超低温保存后，由于受到“冷刺激”作用，其萌发率有明显的提高。但在我们的试验中，无论是干燥法或是玻璃化法保存中都没有发现这一现象，可能与不同花粉的遗传特性有关。另外。超低温保存后花粉的遗传完整性和稳定性有待进一步研究。