摘要：分离、克隆梭鱼脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，简称FAS）基因的部分cDNA片段（GenBank登录号为KJ848474），共920 bp，编码303个氨基酸，序列分析表明梭鱼FAS基因与其他物种的同源性为74%～95%，其中与军曹鱼、斑马拟丽鱼相似性达95%。FAS基因mRNA在梭鱼鱼皮、肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、胃、肠、腹腔脂肪、脑和鳃组织中表达丰度差异显著（P<0.05），脑中含量最高，其次是肝脏和腹腔脂肪组织，肌肉中表达量最低，其余7种组织中的表达量均显著低于脑和肝脏（P<0.05）。此外，还研究了饲料脂肪水平对梭鱼FAS活性和mRNA表达的影响，平均质量为（9.5±0.3）g的梭鱼幼鱼投喂6种不同脂肪含量的等氮等能饲料（脂肪水平分别为2.04%、4.83%、747%、979%、12.01%、14.59%），饲养60 d，试验结束后测定各组梭鱼肝脏中FAS的生物活性及肝脏、腹腔脂肪、肌肉中FAS mRNA的表达丰度。结果表明，随着饲料脂肪水平的升高，肝脏中FAS活性呈降低趋势，14.59%组的活性显著低于2.04%、4.85%组（P<0.05）；肝脏中FAS的mRNA表达量显著下降（P<0.05）；肌肉和腹腔脂肪中FAS的mRNA表达量呈下降趋势，但各组之间差异不显著（P>0.05）。
关键词：梭鱼；脂肪水平；脂肪酸合成酶；克隆；基因表达分析活性；同源性；系统进化树
中图分类号： Q78；Q959.478文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0049-06
属鲻形目鲻科梭属鱼类，是温带浅海区重要的经济鱼类之一，具有广盐性、广温性、适应性广、病害少、味道鲜美等诸多优点，目前是江苏沿海正在开发的海淡水养殖新兴品种之一。在目前的养殖中，较易出现腹部肥大的症状：解剖后，可见肠道表面脂肪覆盖明显，肝脏肥大；此种体形与梭鱼本该具有的长流线形身体不符，不受消费者欢迎；有关梭鱼产生上述症状的原因，目前并无研究。鱼类内脏尤其是肝脏脂肪过度聚积，产生脂肪肝或腹部肥大，这些是由于脂代谢紊乱造成脂肪在内脏内的沉积而出现的病理、生理学改变，它的发生、发展跟脂代谢关键因子有重要联系，脂代谢关键因子在这一过程中到底如何作用？是否可以通过营养调控的角度减少或避免此类症状的产生？脂代谢相关的基因众多，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，簡称FAS）是脂代谢过程中的关键酶之一。动物体内脂肪的沉积量是脂肪的合成和降解过程动态平衡的结果，其合成和分解过程都是通过一系列酶催化完成的。动物体脂沉积所需要的脂肪酸大多来自脂肪酸的全程合成，即由FAS催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸，FAS活性的高低对控制动物体脂沉积具有重要意义[1]。因此，本研究克隆了梭鱼FAS基因的cDNA部分序列，并与其他物种进行同源性比较、系统发生进化树分析组织特异性表达，为进一步研究梭鱼的脂肪代谢机制奠定分子生物学基础。此外，梭鱼的营养需求研究基础薄弱，配合饲料的生产主要借鉴其他杂食性鱼类的营养需要，不合理的营养水平也可能是产生腹部肥大的原因。作为水产动物重要的营养素之一，脂肪是鱼类重要的能源物质，不同的鱼对脂肪的需求不同，饲料中不合理的脂肪水平会导致鱼体腹部累积大量的脂肪[2-3]。因此，本研究针对饲料脂肪水平对FAS基因表达的影响进行初探，从营养和基因表达调控的角度了解梭鱼的脂质代谢，为梭鱼的健康养殖提供理论基础。
1材料与方法
1.1试验设计
基因克隆和组织特异性表达用鱼由江苏省响水县一个养殖场提供，鱼体质量约300 g，运回后饲养于体积约 3 000 L 的水泥池（3 m×1 m×1 m）中，用普通商品饲料喂养，适应2周后即挑选10尾健康的梭鱼，用MS-222麻醉，于无菌操作下解剖，取鱼皮、肌肉、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、胃、肠、腹腔脂肪、脑和鳃11种组织，用液氮速冻后于-80 ℃冰箱中保存备用。
脂肪水平试验用鱼由江苏省射阳县朱平水产苗种有限公司提供，运回后用5%食盐水消毒，然后放入水泥池（3 m×1 m×1 m）中驯养10 d，挑选540尾健康无伤、规格均一的鱼种[均质量（9.5±0.3）g]，随机分为6组，饲养于循环流水养殖桶中（规格：直径80 cm、高度70 cm、体积约300 L），每组设置3个重复，每个重复30尾鱼，分别投喂6种不同的饲料。6种饲料配制如下：以鱼油为脂肪源，添加水平分别为0、25%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%，进口鱼粉、豆粕等为主要蛋白源，制成脂肪含量分别为2.04%、4.83%、7.47%、979%、12.01%、14.59%，蛋白质含量为30.32%的6组等氮等能饲料，配方见已发表文献[4]。正式饲养期间，投饲率为鱼体总质量的3%～5%，每天分3次投喂，投喂时间为 06：30、12：30、18：30，试验期间除投喂外全天充氧，水温控制在（24±2） ℃，养殖60 d。试验结束后饥饿24 h，用MS-222对鱼进行麻醉，每个重复取3尾鱼，无菌操作下取肝脏、肌肉、腹腔脂肪用液氮速冻，然后放入-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2试剂及仪器
Trizol Reagent（Promega）、反转录酶M-MLV、RnaseH、TdT酶、Taq酶、连接酶、SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit试剂盒均购自TaKaRa（大连）；Taq酶、胶回收试剂盒、pUCm-T载体购自上海申能博彩生物科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α由无锡淡水渔业中心农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室保存；定量PCR采用进口Axygen PCR管。鱼FAS酶联免疫分析试剂盒购于上海江莱生物科技有限公司，其他常规化学药品均为分析纯。
荧光定量PCR仪（CFX96TM Real-Time PCR Detection Systerm，美国伯乐Bio-Rad公司）；普通PCR仪（T100TM Thermal Cycler，美国伯乐Bio-Rad公司）；冷冻型台式大容量高速离心机（Centrifuge 5804R，德国艾本德Eppendorf公司）；核酸蛋白测定仪（Biophotometer plus，德国艾本德Eppendorf公司）；超低温冰箱（Forma 900 series，美国热电Thermo公司）；多功能酶标仪（Infinite M200，瑞士帝肯Tecan集团公司）。