摘要：以自行设计的养殖水体微宇宙模型为基础，研究不同浓度下外加光合细菌对养殖水体的影响，结果表明，该菌株能明显有效地去除养殖水体微宇宙模型中积累的ＮＯ２－、ＮＯ３－、ＣＯＤＭｎ，浓度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ时ＮＯ２－、ＮＯ３－的去除率分别达到５８．４％和８９．６％，为最佳投菌浓度。此外，用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ的方法验证了用光合细菌治理养殖水体污染的同时还能有效地增加养殖水体中微生物群落的丰富度，是一种安全有效的微生态菌剂。
关键词：微宇宙；光合细菌；养殖水体；种群多样性
中图分类号：Ｑ９３９．９６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）22－4682-04
Study on the Impact of External Photosynthetic Bacteria on Water Quality and Microbial Community of Aquaculture Water
ＸＩＯＮＧ Ｈｕｉ，ＬＩＡＮＧ Ｙｕｎ－ｘｉａｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Based on the aquaculture water model designed, the effects ofphotosynthetic bacteria with different ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ａｑｕａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ＮＯ２－、ＮＯ３－ ａｎｄ ＣＯＤＭｎ ｉｎ ｗａｔｅｒ． Ｗｈｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｉｌｌｉ ｗａｓ １０４ ＣＦＵ／ｍＬ， ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ＮＯ２－ ａｎｄ ＮＯ３－ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ， ５８．４％ ａｎｄ ８９．６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｉｔ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｔｈａｔ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｓａｆｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｓ ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｒｉｃｈｎｅｓｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｍｅｔｈｏｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ； ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ｗａｔｅｒ； ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
随着水产养殖业的迅速发展，工厂化高密度养殖的规模日益扩大，养殖密度过大，养殖品种单一，养殖生态环境失调，造成大面积养殖生态系统的破坏，从而引发各种病害。养殖水体的污染治理问题亟待解决。益生菌作为一类微生态制剂能改善养殖生态环境，能提高养殖动物的免疫力，减少其疾病的发生，最终以可持续发展的方式提高经济效益［１－４］。
光合细菌（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，简称ＰＳＢ）是一类以光为能源，以自然界中有机物、硫化物等为营养，并能进行光合作用的微生物［５］。它不仅能净化水质［６］，而且含有丰富的营养，可作为鱼虾的饵料添加剂［７，８］，是被广泛运用的微生态制剂之一。
对于外加微生物菌剂是否会因为改变水体中菌群结构而造成潜在生态环境威胁，目前国内尚无文献报道来提供直接证据。研究旨在利用实验室条件下的养殖水体微宇宙模型模拟养殖周期内水质变化过程，通过不同浓度的投菌试验寻找经济有效的投加浓度；同时，利用现代分子生物学分析手段，验证作为外加微生态制剂的光合细菌是否会给养殖生态系统带来物种丰富度降低的风险，研究其对微生物群落丰富度的具体影响。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１供试菌株菌株沼泽红假单胞菌（Ｒｈｏｄｏｐｈｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）由华中农业大学生命科学技术学院发酵工程实验室保藏。
１．１．２微宇宙水体参考经典微宇宙［９］的构建要素，以忠实于实际养殖水体整体环境为前提，综合考虑试验取样及操作的便利性与可重复性，自行设计了如下养殖水体微宇宙模型。
１．２方法
１．２．１水质分析方法水质分析项目包括ｐＨ、总氮（ＴＮ）、铵氮（Ｎ－ＮＨ４＋）、硝酸盐（ＮＯ３－）、亚硝酸盐（ＮＯ２－）、高锰酸盐指数（ＣＯＤＭｎ）、总磷（ＴＰ）、可溶性有机磷（ＳＯＰ）。具体方法参考中华人民共和国国家水质指标测定法［１０］。
１．２．２微生物种群丰富度研究方法分子生物技术的各类方法已被广泛应用于环境微生物种群结构的研究，其中变性梯度凝胶电泳技术（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）是目前可以探知最为完整菌群结构的方法之一［１１］。采用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ的方法研究光合细菌对水体的影响。考虑到试验目的在于研究微生物种群丰富度，要求ＤＧＧＥ电泳结果分辨率高并且条带丰富，因此ＰＣＲ扩增引物采用９６８ｆ／１ ４０１ｒ［１２］，扩增片段为ＤＮＡ的１６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ６～Ｖ８区段，长度约为４６９ｂｐ。ＤＧＧＥ电泳变性胶浓度范围３０％～７０％，采用银染法进行染色。经过温度梯度ＰＣＲ确定ＰＣＲ退火温度为６１ ℃。ＤＧＧＥ电泳胶的图像采用Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ分析条带。微生物种群丰富度采用Ｓｈａｎｎｏｎ－Ｗｉｅｎｅｒ［１３］公式测定，具体计算公式为：Ｈ′＝－∑ＰｉｌｎＰｉ，式中，Ｈ′为微生物多样性指数，Ｐｉ为第ｉ种的个体数与总个体数的比值。用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ软件来辅助计算多样性指数。
１．２．３试验设计按照表１条件设立３个不同投菌浓度的试验组（试验组１、２、３分别按照投菌浓度１０４、１０５、１０６ＣＦＵ／ｍＬ投加光合细菌培养液）及对照组，投菌及添加鱼饲料的频率为2 d一次。每次取样５００ ｍＬ，按照表２方法检测8项水质指标，另取１６０ ｍＬ水样用于水体微生物基因组ＤＮＡ的提取，注意在投加菌液和饲料前将水补齐至标线。
２结果与分析
２．１外加光合细菌对水质指标的影响
试验组１、２、３从试验第１２天开始投菌，如图中箭头所示，设立不投菌的空白对照组ＣＫ，以观察相对ＣＫ外加菌剂对指标的影响。图１显示了氮素各指标在这株光合细菌作用下的变化曲线。图１a显示３个试验组和对照（ＣＫ）的ＴＮ均持续增加，将各变化曲线进行二次函数拟合，比较其斜率发现，３个试验组都高于ＣＫ。其中试验组１、２、３的增幅分别超过ＣＫ的１４．２％、９．２％、１８．７％。图１b显示投菌后N-ＮＨ４＋曲线先升后降，投菌浓度最低的试验组1的N-ＮＨ４＋浓度比试验组2和3都要高，说明较高投菌浓度下该菌有降低N-ＮＨ４＋的作用。ＮＯ３－的变化曲线显示（图１c），试验组１的１０４ＣＦＵ／ｍＬ投菌浓度下ＮＯ３－浓度可低于同期ＣＫ的８９．６％，是试验中获得的最高ＮＯ３－去除率。图１d显示，各试验组的ＮＯ２－终浓度均低于ＣＫ，以ＣＫ的ＮＯ２－终浓度为标准，３个试验组对ＮＯ２－的去除率分别达到了５８．４％、１４．０％、９．４％。由此可见，当投菌浓度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ时ＮＯ２－和ＮＯ３－的去除率均达到最高值，又由于ＮＯ２－是养殖水体水质的关键性指标，故其可视为本试验条件下的最适投菌浓度。
试验由第１２天开始投菌，如箭头所示。由图２a中试验组１的曲线可知，该菌株在投菌后的６ d（即试验第１２～１８天）内能明显降低ＴＰ，而后ＴＰ上升。ＳＯＰ的曲线（图２b）表明，只有在投菌浓度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ时，持续投菌６ d内（即试验第１２～１８天）能降低水体中ＳＯＰ的含量。从图３a可见，同样以ＣＫ为参照，试验结束时，试验组１、２、３的ＣＯＤＭｎ分别降低了１９．１％、３２．２％、６．０％。从图３b可见，对ｐＨ的影响不大，即使在高投菌浓度下也能保证水体中的ｐＨ在７．０与７．６之间波动。
２．２外加光合细菌对水体中微生物群落丰富度的影响
以最适浓度１０４ＣＦＵ／ｍＬ为条件，设置３个平行试验组，对光合细菌影响水体微生物群落的结果进行分析，由于３组试验的PCR-ＤＧＧＥ电泳图结果相似，以试验组１为例说明结果。在第５次取样即第５天后，开始向试验组１投加光合细菌。对比ＣＫ和试验组１的PCR-ＤＧＧＥ电泳图上的条带数目变化（图４、图５），试验开始时，条带均为６，在投加菌剂后，第２组条带数目都有所增加。试验结束时，ＣＫ条带数目为１２，试验组１的条带数则达到３０，是前者的２．５倍。即投加光合细菌后，使得水体中微生物种类达到了自然条件下的２．５倍，明显增加了种类丰富度。
以上是直观地从微生物种类数量上分析的结果。若将微生物量的变化考虑在内，以Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ软件分析PCR-ＤＧＧＥ电泳图后报告的条带相对峰值为统计对象，计算多样性指数Ｈ′并分析结果如图６所示，结果表明加入光合细菌能明显提高水体中微生物的多样性，且具有持续性。
３小结与讨论
利用养殖水体微宇宙模型，针对实验室分离获得的一株光合细菌进行了试验。试验结果表明，这株光合细菌具有明显降低亚硝酸盐（ＮＯ２－）、硝酸盐（ＮＯ３－）和ＣＯＤＭｎ的作用。对比３个投菌浓度的试验结果，１０４ＣＦＵ／ｍＬ的投菌浓度下能使得ＮＯ２－和ＮＯ３－的去除率分别达到５８．４％和８９．６％，为最适投菌浓度。投加光合细菌后３个浓度试验组中的N-ＮＨ４＋都呈现先上升后下降的变化趋势，这与类似试验研究结果相同，如吴伟［１４］认为，这是因为其本身是活菌制剂，随着菌体包括培养基的导入，有机质含量相应会有所增加，并且由于伴随着菌体的代谢降解，N-ＮＨ４＋会先上升。该菌有一定的降低ＣＯＤＭｎ的能力。它对于水体磷素的去除作用仅表现在前６ d，继续投加反而会使水体磷素增加。另外，还考察了最适投菌浓度下该光合细菌对水体中微生物群落丰富度的影响。对比条带数目以及多样性指数Ｈ′的变化趋势，向水体投加光合细菌能够从种类和数量上大幅增加微生物群落丰富度，能使微生物的种数达到原水体自然情况下的２．５倍。说明外加光合细菌有助于增强水体自身抵抗不良环境的能力，帮助养殖水体增强自净功能。
在水产养殖业中，水体中ＮＯ２－以及N-ＮＨ４＋的浓度过高会引起鱼、虾等致病，是影响产量的主要因素［１５］。这株光合细菌和国内外报道的大部分从自然条件下筛选分离的光合细菌一样，具有明显降低ＮＯ２－、N-ＮＨ４＋以及ＣＯＤＭｎ的能力。但是，光合细菌在不同环境条件以及底物浓度下的处理效率差别较大，如光照强度作为单一变量时，N-ＮＨ４＋的去除率就可在２０．５８％和７０．４５％间变化［１６］。由于养殖水体属于人工生境，这个特殊条件下各物质不同浓度对氮磷去除率的影响还有待进一步研究。
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