摘 要：为提高农杆菌介导的杜仲下胚轴遗传转化效率，本研究以杜仲种子为材料，采用正交试验设计，研究了NAA浓度、种子切割方式及光照强度对杜仲萌发及下胚轴直径和长度的影响；获得筛选标记草铵膦用于杜仲遗传转化的适宜浓度，并对杜仲抗性芽生根方式进行了优化。结果表明：NAA （0.5 mg/L） ，正中横切，暗培养15 d，能有效的促进杜仲种子萌发及下胚轴的生长。本试验条件下杜仲种子萌发率可达95%，下胚轴直径1.21 mm，长度22.5 mm；以0.25 mg/L的草铵膦能够对杜仲转基因抗性芽进行有效筛选；成功获得转EuABP2基因表达的杜仲转基因植株12株。
关键词：杜仲；EuABP2基因；遗传转化；下胚轴
中图分类号：Q943.2
文献标识码：A
文章编号：1008-0457（2018）03-0033-07 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.03.006
Genetic Transformation of EuABP2 Gene into the Hypocotyl of Eucommia Ulmoides Oliv. [Garryales： Eucommiaceae] via Agrobacterium-mediated Method
ZHOU Shuting1， DONG Xuan1， 2，ZHAO Yichen1， 2*， ZHAO Degang1， 3
（1.The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）/ Guizhou Key Lab of Agro-Bioengineering， Institute of Agro-Bioengineering and College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China； 2.The 2011 Collaboration Innovation Center for Mountain Ecology and Agro-Bioengineering in Guizhou Province， Guizhou University， Guiyang 550025， Guizhou， China；3.Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang， Guizhou 550006， China）
Abstract：To improve the efficiency of genetic transformation of Eucommia ulmoides hypocotyl via Agrobacterium-mediated method， we used Eucommia ulmoides seed as the research material to systematically investigate the influence of NAA concentration， seed cutting mode and light intensity on germination and hypocotyl diameter and length. Appropriate concentration of glufosinate for the genetic transformation of Eucommia ulmoides was obtained. Rooting method of Eucommia ulmoides resistant roots was optimized. The results showed that NAA （0.5 mg/L）， mid cut and dark culture for 15 days could effectively promote the germination and hypocotyl growth of Eucommia ulmoides seed. Under these conditions， the seed germination rate was up to 95%， the diameter of hypocotyl reached 1.21 mm and its length was up to 2.25 cm. Glufosinate at 0.25 mg/L could effectively screen the transgenic resistant buds of Eucommia ulmoides. In addition， by keeping partial hypocotyl and promoting rooting， Twelve EuABP2 gene-expressed Eucommia ulmoides plants were successfully obtained.
Key words：Eucommia ulmoides olive； EuABP2 gene； genetic transformation； hypocotyl
杜仲 （Eucommia ulmoides Oliv.） 又名胶木[1]，为杜仲科杜仲属落叶乔木，原产于中国，为我国特有的第三纪孑遗植物种[2]，杜仲不仅是我国特有的传统名贵中药材[3]，也是重要的含胶植物，在中国的分布以秦岭以南各省为主，主要分布于云南、贵州等地[4]。近年来对杜仲的研究主要集中在化学成分分离，而分子生物学研究尤其是功能基因的分离与应用报道较少。研究植物功能基因的重要途径是利用转基因技术进行功能验证。研究表明，木本植物转基因研究的最佳外植体应是下胚轴[5-6]。作为木本植物之一的杜仲，种子发芽率不高，获得优良下胚轴往往比较困难[7]。已有研究报道种子的萌发及下胚轴生长与生长素浓度[8-9]、种子切口方式[10-11]及光照条件[12]有关。目前，已有一些对杜仲再生和遗传转化体系的研究报道，左春芬等人[13]最早涉及这方面的研究，他们用杜仲幼嫩树枝为外植体诱导出愈伤组织，但未能获得再生植株。1994年，夏启中、宋太伟等[14]以杜仲实生苗茎尖为外植体，获得了完整的再生植株。朱登云等[15]以杜仲成熟干胚乳、叶片、叶柄诱导愈伤组织并再生植株，诱导效率在13%以上；王东良等[16]以1/3MS附加0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA诱导生根，生根率为18%；李岩等[17]在含有0.1 mg/L NAA+0.8 mg/L 6-BA的MS培养基中直接诱导杜仲胚轴产生不定芽，诱导率达到47%，赵丹等[18]采用农杆菌介导法，以杜仲下胚轴为转化受体对杜仲进行遗传转化，研究了卡那霉素浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影響，成功获得了转基因杜仲植株，阳性植株获得率可达45%；Chen等[19]对杜仲无菌苗进行悬浮培养，以杜仲下胚轴为转化受体，超声处理后采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化并改进了培养基配方。
为了建立一种杜仲遗传转化效率高、稳定性好、通用性强的外源基因导入的遗传转化技术[20-22]，用于目标基因的功能验证和基因工程改良杜仲，本研究以培育优良杜仲下胚轴为目标，通过分析NAA浓度、种子切口方式及光照强度对萌发杜仲下胚轴及下胚轴直径和长度的影响，以便优化和确定获得优良杜仲下胚轴萌发及生长的最适条件，并构建了Act1启动子驱动杜仲EuABP2表达的植物表达载体，遗传转化杜仲下胚轴，以草铵膦浓度进行筛选，确定优化的遗传转化条件，为杜仲遗传改良及杜仲基因的功能鉴定奠定技术基础。
1 材料和方法
1.1 供试材料
本试验所用杜仲种子取自贵州大学转基因植物试验示范基地杜仲植株。质粒载体、菌株和PCR检测引物均由贵州大学农业生物工程研究院保存。遗传转化所用根癌农杆菌菌株为LBA4404，构建的pGM626-Act1-EuABP2载体包含由UBi启动的Bar：：GUS筛选标记以及由Act1启动的EuABP2，目的基因由NOS终止 （图1）。
1.2 试验方法
1.2.1 工程菌制备及PCR检测
将含有表达载体pGM626-Act1-EuABP2的质粒通过冻融法[23]转化农杆菌株LBA4404以制备工程菌株。取-80℃保存的LBA4404感受态细胞置于冰中解冻10 min；向每支感受态细胞中加入5 μL质粒DNA，轻轻弹动混匀后冰浴30 min；液氮速冻5 min后，立即37℃水浴2 min；加入900 μL 37℃预热YEP液体培养基，28℃，200rpm振荡培养3 h；室温，4000×g离心1 min后，弃上清；向菌体中加入100 μL YEP液体培养基，用枪头吸打使之混匀；取适量菌液涂布于含有100 mg/L Kan和20 mg/L Rif的YEP平板培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养2d，-80℃保存菌液。
1.2.2 杜仲种子萌发及下胚轴生长条件的筛选
1.2.2.1 杜仲种子消毒
收集成熟的杜仲种子；剥掉种子外壳，用清水浸泡12 h；用含表面活性剂的洗手液清洗种子并以自来水冲洗30 min，直至洗手液完全冲洗干净；超净工作台上用75%酒精浸泡30 s，无菌水漂洗1～ 2次后用有效氯为10%的NaClO溶液浸泡20 min，期间用镊子轻轻搅动，无菌水漂洗4～5次。
1.2.2.2 正交试验设计
利用正交试验方法[24]，按SPSS 17.0 正交优化试验设计，输入多因素条件，以SPSS软件分析，自动生成正交试验组合（见表2）。采用的杜仲种子处理有切割方式 （不切割、单端切割、两端切割和正中横切），置不同浓度的NAA （0 mg/L、0.5 mg/L、5 mg/L、50 mg/L） MS培养基、不同光照条件 （光培、暗培） ，杜仲种子处理后在MS培养基上培养15 d，观察记录不同处理杜仲种子发芽率和杜仲下胚轴的长度及直径。由于下胚轴的生长状况弯曲不定，测其长度时，先用细绳随下胚轴弯曲摆放来替代其生长趋势，然后再用直尺来测量细绳的拉直长度，以此得到下胚轴的长度。下胚轴的直径取最大值与最小值的平均值，下胚轴的最大直径和最小直径直接用游标卡尺来进行精确测量。
1.2.3 外植体制备及预处理
将萌发15 d的杜仲幼苗从种子萌发培养基中取出，轻轻洗去附着在幼苗上的培养基，并将幼苗移入悬浮培养液中悬浮培养3 d，然后置于无菌吸水纸上吸干培养液，将无菌苗切成5～8 mm小段，去除茎尖生长点部分。将切好的杜仲外植體放入重悬液中，超声处理20 min后以备转化。
1.2.4 草铵膦抗性浓度筛选
切取未经农杆菌侵染的杜仲15 d苗龄无菌苗下胚轴20个，分别接种于MS含0 mg/L、0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L Bar的筛选培养基上，30 d时观察并统计下胚轴上生长的不定芽数。
不定芽诱导率=（生长出不定芽的下胚轴数÷接种的下胚轴数）×100%。
1.2.5 菌种活化及预处理
取-80℃保存的含有pGM626-Act1-EuABP2植物表达载体的LBA4404菌株，涂平板接种于含100 mg/L Kan 和20mg/L Rif的YEP固体培养基上，28℃下倒置暗培2 d，待菌落长出，挑取阳性单菌落接种于5 mL含100 mg/L Kan 和20 mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃摇床上200 r/min振荡活化培养16～20 h，取50～100 μL菌液接种于相同的YEP液体培养基中，继续培养至OD600值为0.5～0.6，5000 g 4℃离心10 min，弃上清，用重悬液重悬菌体至OD600值为0.25～0.3，在菌体重悬液中加入10 μL表面活性剂备用。
1.2.6 农杆菌介导杜仲遗传转化
将超声处理20 min后的杜仲外植体置于菌体重悬液中侵染，侵染时间3 min。取出侵染结束的杜仲外植体置于无菌纸上吸干菌液，紧密排布于共培培养基上，28℃暗培3 d后转移到筛选培养基上培养，每15 d换一次筛选培养基。将分化出抗性芽的杜仲外植体从中间部位切断，保留部分下胚轴以促进生根，将外植体上未产生不定芽的一段插入培养基中培养，每15 d换一次生根培养基，统计阳性植株获得率及不定芽的生根率。
阳性植株获得率=（阳性植株数÷获得的植株数）×100%。
生根率=（生根的不定芽数÷接种的不定芽数）×100%。
1.2.7 GUS基因组织染色的检测
将筛选出杜仲抗性芽叶片置于GUS组织化学染色液中侵泡，抽真空10 min，37℃温育6 h，然后使用75%和95%的乙醇脱色12 h，观察、镜检并照相。
1.3 数据处理
试验数据采用Microsoft office Excel 2003及SPSS 17软件进行处理和分析，多重比较采用Duncan法。
2 结果与分析
2.1 工程菌的PCR鉴定
提取经Kan筛选获得的阳性农杆菌单菌落DNA，进行PCR后电泳观察，结果表明，所选择的阳性菌株中含有与目的基因大小一致的扩增片段，可认为质粒pGM626-Act1-EuABP2已经成功转化所选择的阳性农杆菌菌株。
2.2 各因素对杜仲种子萌发及下胚轴生长的影响
通过正交试验结果（表3）的极差分析表明，NAA处理浓度的R值（极差，数值越大证明对结果影响越大）最大，为1.388，切割方式的R值最小，为0.228（表4），说明NAA浓度对杜仲种子下胚轴长度生长影响最大，其次为光照条件，而切割方式影响最小。方差分析表明，NAA浓度和光照条件对杜仲种子下胚轴长度的影响达显著水平，而切割方式对其影响不显著（表5）。
对各因素不同水平条件下的杜仲种子萌发率及幼苗生长状况研究表明，未经切割的第3、8、12组的杜仲种子萌发率只有30%左右，分别为35%、30%和25%。第16组未经切割但在浓度为0.50 mg/L的NAA促进作用下，种子萌发率达到58%，而其余经过切割的杜仲种子萌发率均高于不切割时种子的萌发率，正中横切时种子萌发率最高可达95%，最低为60%；单端切割时种子萌发率最高可达95%，最低为52%；两端切割时种子萌发率最高可达94%，最低为51%。NAA浓度为0.5 mg/L时，采用正中横切，杜仲下胚轴长度最大。不切割和正中切割，NAA浓度在0～0.5 mg/L之间时，下胚轴长度随NAA浓度增大而增大。采用单端切割或两端切割，NAA对下胚轴生长起抑制作用。在NAA浓度为5 mg/L时，不切割和两端切割的处理中杜仲直径最大。NAA浓度为0～5 mg/L时，对杜仲下胚轴径粗生长起促进作用；NAA浓度大于5 mg/L则抑制径粗生长。本试验条件下，光照对根生长的影响不显著。因而，最适宜杜仲下胚轴生长的条件为：NAA浓度0.5 mg/L ，正中横切，暗培养15 d，种子萌发率达到95%，下胚轴直径可达1.21 mm，长度可达22.5 mm。
2.3 Bar最适宜抑制浓度筛选
对30 d后不同浓度Bar筛选培养基上接种的未经农杆菌侵染的杜仲15 d苗龄无菌苗下胚轴生长状况统计进行，结果显示：Bar浓度为0 mg/L时，不定芽诱导率为83%；Bar浓度为0.25 mg/L时，不定芽诱导率为37%；Bar浓度为0.50 mg/L时，不定芽诱导率为12%；Bar浓度为1.00 mg/L时，不定芽诱导率为0%。当Bar浓度为0.25 mg/L时，杜仲无菌苗下胚轴不定芽诱导率为37%明显受抑制，为平衡不定芽诱导率及筛选效率，选Bar浓度为0.25 mg/L为筛选浓度（表8）。在对筛选标记草铵膦的筛选浓度进行选择时，本研究选择了对杜仲分化有显著抑制但又不完全抑制的浓度 （0.25 mg/L） ，浓度过高会造成杜仲不定芽诱导率极低，浓度过低则无法满足筛选效率，当筛选标记草铵膦的筛选浓度为0.25 mg/L时，既能得到较高的杜仲不定芽诱导率，又能起到一定的筛选作用，而未被筛选掉的抗性芽会通过GUS组织染色进一步筛选。
2.4 杜仲下胚轴转化效率分析
通过本实验的方法遗传转化杜仲后得到14株杜仲转基因植株，GUS组织染色初步检测获得12株阳性植株，阳性植株获得率可达85.7%。通过采取保留部分下胚轴以促进生根的方式成功诱导7株不定芽生根，生根率可达58.3%。杜仲下胚轴遗传转化过程及GUS染色情况见图4。
3 结论与讨论
外源基因导入的遗传转化技术是目标基因的功能驗证和基因工程改良育种的重要步骤，由于木本植物和草本植物在生长发育条件、器官部位等方面有相当大的差异，尤其是木本植物中较多的多酚类物质会阻碍细胞分裂和生长，导致木本植物组织培养再生体系的建立十分困难，而杜仲作为一种木本植物其再生体系，以及遗传转化体系的建立一直以来都是研究的难点。在前期实验中我们发现杜仲种子萌发率低，且不易获得满足遗传转化条件的下胚轴，而下胚轴萌发情况是影响转化效率的关键因素之一。本研究通过对光照条件，生长素浓度及种子切割方式的种子萌发条件的优化，使杜仲种子萌发率达到95%，获得大量适用于遗传转化的下胚轴，大大降低了杜仲遗传转化中的工作量。在以优质的杜仲下胚轴为遗传转化的材料，基于赵丹、Chen的研究结果进行遗传转化，阳性植株获得率较本实验室前期显著提高，由45%提高到85.7%。通过保留部分下胚轴以促进生根的方式显著提高了不定芽的存活率，成功诱导不定芽生根，生根率可达58.3%，本实验的研究工作为杜仲下胚轴遗传转化提供了技术支持，为杜仲功能基因的研究奠定了基础。
参 考 文 献：
[1] 张宏达.中国植物志 [M]. 北京：科学出版社， 1998.
[2] 中国科学院中国植物志委员会.中国植物志 .第六十四卷 .第一分册 [M]. 北京：科学出版社， 1979.
[3] 李 竹， 晏 媛， 李 青.杜仲的药理活性研究进展 [J]. 中国药事， 2004， 18（2）： 131-132.
[4] 王娟娟， 秦雪梅， 高晓霞， 等.杜仲化学成分、药理活性和质量控制现状研究进展 [J]. 中草药， 2017， 48（15）： 3228-3237.
[5] 罗 丽.杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）组织培养技术体系建立及外源基因导入的初步研究 [D].贵阳：贵州大学， 2003.
[6] Chen R， Namimatsu S， Nakadozono Y， Y Nakazawa， K Gyokusen.Efficient Regeneration of the Eucommia ulmoides Oliver Plant from Hypocotyl Explant [C]. International Symposium on Eucommia ulmoides，2007（1）：75-77.
[7] 芮和恺， 顾慧芬， 忻晓君， 等.几种细胞分裂素和生长素对杜仲下胚轴离体培养的影响 [J]. 上海交通大学学报（农业科学版）， 1988 （1）：37-40.
[8] 杨荣超， 张海军， 王 倩，等.植物激素对种子休眠和萌发调控机理的研究进展 [J]. 草地学报， 2012， 20（1）： 1-9.
[9] M Miransari， DL Smith.Plant hormones and seed germination [J]. Environmental & Experimental Botany， 2014， 99（3）： 110-121.
[10] 傅 强， 杨期和， 叶万辉.种子休眠的解除方法 [J]. 基因组学与应用生物学， 2003， 3（3）： 230-234.
[11] 陈 伟， 马绍宾， 陈宏偉.种子休眠类型及其破除方法概述 [J]. 安徽农业科学， 2009， 37（33）： 16237-16239.
[12] 王 艺， 韦小丽.不同光照对植物生长、生理生化和形态结构影响的研究进展 [J]. 山地农业生物学报， 2010， 29（4）： 353-359.
[13] 左春芬.黑节草的组织培养 [J]. 植物生理学报， 1985 （1）： 37.
[14] 夏启中， 宋太伟， 易咏梅，等.杜仲组培快速繁殖的研究 [J]. 湖北民族学院学报（自科版）， 1994 （2）： 55-56.
[15] 朱登云， 蒋金火， 裴德清， 等.由杜仲成熟干种子胚乳培养再生完整植株 [J]. 科学通报， 1997， 42（5）： 559-600.
[16] 王东良， 丁 兰， 魏昊进.杜仲组织离体培养研究 [J]. 西北师范大学学报（自然科学版）， 2004， 40（1）： 64-66.
[17] 李 岩， 罗 丽， 赵德刚.杜仲胚轴、子叶直接诱导不定芽及再生体系的建立 [J]. 中草药， 2007， 38（1）： 101-105.
[18] 赵 丹， 赵德刚， 李 岩.EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究 [J]. 基因组学与应用生物学， 2009， 28（1）： 27-33.
[19] R Chen， H Yoko， B Takeshi，et al.Overexpression of an isopentenyl diphosphate isomerase gene to enhance trans -polyisoprene production in Eucommia ulmoides Oliver [J]. BMC Biotechnology，2012， 12（1）： 78.
[20] 黄 勇.杜仲组织培养的初步研究 [D]. 武汉：华中师范大学， 2003.
[21] 李 琰， 张 靖， 辛转霞， 等.杜仲组培快繁的研究 [J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2004， 32（6）： 79-82.
[22] 唐 亮， 金晓玲.杜仲组织培养的研究进展 [J]. 贵州农业科学， 2010， 38（3）： 15-18.
[23] 王学全， 沈 晓， 何赟绵， 等.根癌农杆菌EHA105和LBA4404冻融法转化条件的优化研究 [J]. 药物生物技术， 2011（5）： 382-386.
[24] 刘瑞江， 张业旺， 闻崇炜， 等.正交试验设计和分析方法研究 [J]. 实验技术与管理， 2010， 27（9）： 52-55.