基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株 内生细菌B69菌株由课题组从人参根中分离得到，经鉴定为死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis），保存在吉林农业大学药用植物栽培研究室。人参根腐病病原菌[Fusarium solani（Mart.） App. et Wollenw]，由吉林农业大学菌物研究中心提供。
1.1.2 供试植株 人参根腐病防效试验所用的人参植株采自吉林省白山市抚松县万良镇，5年生。
1.1.3 供试培养基及其他试剂 供试细菌的保存和培養使用营养琼脂（NA）培养基;供试细菌液体发酵培养使用营养肉汤（NB）基础培养基;病原真菌使用马铃薯葡萄糖（PDA）固体培养基;此外还使用了PDA液体培养基。试剂主要有 10 mg/mL 利福平（Rif）溶液（95%乙醇溶解），羧甲基纤维素钠（CMC），10%多菌灵可湿性粉剂，均由吉林农业大学药用植物栽培研究室提供。
1.1.4 试验场地 人参田间试验于2017年6—9月在吉林农业大学药用植物科技示范园进行，采用一面坡式荫棚遮荫种植。
1.2 试验方法
1.2.1 抗利福平突变菌株的筛选 将活化好的拮抗细菌在32 ℃、180 r/min摇床中培养2 d制成拮抗细菌种子液。取 10 mL 种子液接种在含 20 μg/mL Rif的NB培养液中。在 30 ℃、180 r/min摇床中振荡培养4～5 d后，如果培养液变浑浊，则吸取10 mL接入Rif浓度为40 μg/mL的100 mL NB培养基中，以后每次培养液中Rif的浓度依次增加，直至标记至300 μg/mL，Rif的浓度分别为40、60、80、100、150、200、300 μg/mL。然后用含300 μg/mL Rif的NB培养基平板检测并挑取能稳定生长，且拮抗活性、菌落形态变化不大的标记菌株。为检测其遗传稳定性，将其在NB培养基（不含Rif）中连续培养10代后涂布于含300 μg/mL Rif的NB培养基平板上，观察是否能正常生长。为检测其拮抗稳定性，采用平板扩散法[10]，以原始菌株为对照，观察抑菌率是否存在差异。
1.2.2 抗利福平标记菌株在人参土壤中的定殖 采用灌根接种法[11]，每盆3株，于第1天、第3天、第5天、第7天、第10天、第15天、第20天、第30天分离根际土壤的细菌，在含有 300 μg/mL 的利福平NA培养基平板中均匀涂布稀释液，3 d 后计数，计算含菌量。
1.2.3 细菌在植株内的定殖 采用灌根接种法[11]，用盆钵种植方式，分别于接菌后第7天、第10天、第15天、第20天、第30天时随机取2株人参苗进行根部、茎、叶目标菌株的分离、回收。
1.2.4 内生菌株B69对人参根腐病防效的盆栽试验 盆栽试验采用保护法和治疗法，待人参展叶期时，采用灌根接种法接种B69菌株发酵菌液和根腐病病菌孢子悬浮液。保护法：先接种B69菌株发酵菌液，3 d后再接种3×104个/mL根腐病病菌孢子悬浮液;治疗法：先接种3×104个/mL根腐病病菌孢子悬浮液，3 d后再接种B69菌株发酵菌液;以接种无菌发酵液为对照。每个处理5盆，每盆3株人参苗，20 d灌根1次，每株接种B69菌株发酵菌液的浓度为108 CFU/mL，接种量为 50 mL，共灌根5次。处理完成20 d后随机取5株人参苗观察根腐病发病情况，病情指数分级方法参考马凤茹等的方法[12]。
1.2.5 内生菌株B69对人参田间病害的防治效果 田间试验采用随机区组设计，共设置4个处理，每个处理3个小区，小区面积为3.0 m2。处理1：单接病原菌;处理2：生防菌+病原菌;处理3：10%多菌灵可湿性粉剂+病原菌;处理4：未进行处理（CK）。待人参苗完全展叶后开始处理，处理1每个小区每株浇灌50 mL病原菌液;处理2每个小区每株浇灌 50 mL 根腐病病菌液+50 mL B69菌株发酵菌液;处理3和4每个小区喷施4 g/m2药液或清水。每隔20 d处理1次，共处理5次。
人参田间试验每个处理分别在7月5日、8月8日、9月10日调查3次，每个小区随机选择5点，每点调查10株，记录总叶片数和各叶片发病级数，计算出各处理的病情指数和防治效果。病害严重度分级，即人参根腐病发病程度参考马凤茹等的方法[12]进行分级计算。
2 结果与分析
2.1 抗利福平突变菌株的筛选
通过对B69菌株进行抗利福平筛选，得到能在含利福平的NA固体培养基上稳定生长，且菌落形态、颜色等与原始菌株相同的突变菌株（图1、图2）;在不含利福平的NB液体培养基中振荡培养后，其培养液对根腐病菌仍具有抑制作用，且与原始菌株的抑制效果基本相同。
2.2 抗利福平突变菌株的遗传稳定性
挑取抗利福平的突变标记菌株，在不含利福平的NB液体培养基中连续培养10代后，仍能在含利福平的NA固体培养基上生长（图3、图4），表明这株生防菌株的突变菌株具有遗传稳定性，可用于定殖研究。
2.3 内生菌B69菌株在人参植株内及其根际土壤中的定殖动态
2.3.1 内生菌B69菌株在根际土壤中的定殖动态 由图5可知，B69菌株具有较好的土壤定殖能力。随着时间的延长，其在自然土和灭菌土中定殖量的消长动态一致，均呈现先降后升再降的趋势。B69菌株在灭菌土中的定殖量小于在自然土中的定殖量，在灭菌土中的定殖量变化幅度则大于在自然土中的定殖量变化幅度。分析其原因可能是因为土壤灭菌后其理化性质、土壤微生态结构遭到破坏，且没有其他微生物对所接入生防细菌的影响，从而可能相对不利于生防细菌定殖能力的发挥。B69菌株在土壤中定殖的初始菌量为1×107 CFU/g，第3天后在灭菌土和自然土中定殖量迅速下降，第10天定殖量达到1个峰值，在自然土和灭菌土中分别为6.57×106、4.25×106 CFU/g;第10天以后随着处理时间的延长定殖量逐渐减少，但在第30天B69菌株在自然土和灭菌土中的定殖量仍可达到105 CFU/g以上。
2.3.2 内生菌B69菌株在人参植株内的定殖动态 人参定苗的进行标记菌株发酵液灌根，第3天开始定期检测标记菌株在人参根、茎、叶中的定殖数量，发现植株的根中可检测到菌株，但对照中无。从定殖数量上看，B69菌株在人参植株的根内定殖数量最大，茎中次之，叶中最少（图6，图7）;随着定殖时间的延长，各部分定殖菌量呈现先增后减的趋势，这说明细菌进入植物体内的途径可能与根部有关。B69菌株在人参体内表现出一定的定殖能力，从不同处理来看，自然土中菌株在人参体内的传导能力优于灭菌土，且自然土中的定殖菌量高于灭菌土，因此推断自然土中存在的某些微生物可能有利于B69菌株的定殖。自然土中生防菌株B69在人参根、茎、叶内的最大定殖量均出现在第15天，分别为3.54×106、5.26×105、2.12×105 CFU/g;灭菌土中生防菌株B69在人参根、茎、叶内的最大定殖量也出现在第15天，分别为2.11×106、
2.62×105、5.83×104 CFU/g。
2.4 内生菌B69发酵液对人参根腐病的盆栽防效
由表1可以看出，内生菌B69菌株发酵液对根腐病的防治效果明显。采用保护作用处理的防效优于治疗作用处理的防效，两者的防效分别达到60.8%、56.6%，表明菌株B69发酵液的预防作用效果较好，但两者防效差异不显著。保护作用处理和治疗作用处理的病情指数分别为25.32、28.11，均低于对照处理的47.83，差异达到显著水平（P<0.05）。
2.5 内生菌B69对人参根腐病的田间防效
由表2可以看出，在不接种病原菌的CK中，根腐病发病的病情指数为41.58，CK组的病情指数可达单接根腐病病菌组的67%左右。结果表明，5年生人参苗本身已经存在发病机制，若不接种根腐病病菌，供试人参苗亦可发病。在单接根腐病病菌对照中，病情指数为61.34;在内生菌B69菌株与根腐病病菌混接处理中，病情指数为25.41，其对根腐病的相对防效为58.56%;而在10%多菌灵可湿性粉剂与根腐病病菌混接处理中，病情指数为28.14，其对根腐病的相对防效为54.12%。可见，生防菌B69菌株对人参根腐病具有更好的防治效果，且其相对防效显著高于农药处理组（P<0.05）。
3 结论与讨论
研究表明，定殖是生防菌发挥作用的重要因素，许多室内防治效果显著的菌株在田间很难达到预期的效果，究其原因是不能有效定殖于植物根际或体内[13]。本研究采用抗生素标记法，筛选出最佳标记菌株。定殖动态结果表明，B69菌株在人参根际可有效定殖30 d以上，覆盖人参的整个旺盛生长期，表明B69菌株在生产实践上具有较大的生物防治潜力。
细菌作为生防菌防治植物病害主要是利用其强力的竞争机制，其中芽孢杆属（Bacillus spp.）由于具有抗逆性强、繁殖速度快、易于培養等优点而被广泛用作生防菌源[14]。Dionisio利用B. amyloliquefaciens DGA14防治香蕉的冠腐病取得了较好的效果[15];Chen等利用B. amyloliquefaciens S20控制茄子的细菌性枯萎病效果显著[16];贾斌等利用解淀粉芽孢杆菌拮抗人参黑斑病病菌，抑制率达到80%[17]。本研究结果表明，死谷芽孢杆菌B69菌株对根腐病病菌抑制效果明显。盆栽试验结果表明，采用保护作用处理的防效优于治疗作用处理的防效，两者的防效分别达到60.8%、56.6%，表明B69菌株发酵液的预防作用效果较好。保护和治疗作用处理的病情指数分别为25.32、28.11，均显著低于对照组的47.83（P<0.05）。田间试验结果表明，人参在栽植后单接根腐病病菌的病情指数为61.34;在生防菌与根腐病病菌混接处理中，人参在栽植后的病情指数为25.41，其对人参根腐病的相对防效为 58.56%;而在10%多菌灵可湿性粉剂与根腐病病菌混接处理中，人参在栽植后的病情指数为28.14，其对人参根腐病的相对防效为 54.12%，可见，B69菌株对人参根腐病具有更好的防治效果，且其相对防效较农药组高4.44%。因此验证了B69菌株是防治根腐病的良好菌源，具有较大的开发潜能。
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