报告指出，甲氨蝶呤的多药耐药与药物相互作用常與P-gp和OATs有关[7-9]。乌苯美司（bestatin）是临床上常用的一种免疫增强剂，用于配合其它化疗药物的治疗。当甲氨蝶呤与乌苯美司合用时，这些转运体是否影响二者体内动态和临床疗效也不明确[10-12]。因此，本实验目的是建立灵敏、高效的LC-MS/MS检测方法阐明甲氨蝶呤和乌苯美司相互作用分子药代学机制。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent HP1200 液相色谱系统（美国Agilent公司）API 3200 型三重四级杆质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；FCR 2002-UF型纯水机（德国FLOM公司）；HSC-24B型氮气吹干仪（中国天津恒奥科技有限公司）；ST-16R型高速离心机（德国Thermo公司）；AL104万分之一电子天平（梅特勒仪托利多公司）。
1.2 试剂
乌苯美司对照品（深圳万乐药业有限公司，批号：H2006 7632，纯度>99.0%）；甲氨蝶呤对照品（美国sigma公司，批号：119H1449，纯度>99.0%）；西洛他唑原料药（IS， 浙江金立源药业有限公司，批号：H20083045，纯度>99.0%）；甲醇为色谱纯（美国Tedia公司），其他试剂均为分析纯。
1.3 研究对象
健康幼年雄性Wistar大鼠，体重220～250 g由大连医科大学SPF实验动物中心提供，洁净级，许可证号：SCXK（辽）2008-0002。OAT1和OAT3细胞由中科院上海药物所宫丽琨教授友情提供。MDR1-MDCK细胞由浙江大学曾苏教授友情提供。K562、K562/ADR细胞购自凯基生物。
2 方法与结果
2.1主要溶液的配制
2.1.1 对照品溶液的配制 分别精密称取乌苯美司和甲氨蝶呤标准品10.1 mg，用甲醇∶水（50∶50，v/v）溶液精确定容于10 mL容量瓶中得到1.00 mg/mL的储备液I及2.00、5.00、20.00、50.00、200.00、500.00和2000.00 ng/mL标准系列浓度的标准品溶液；配制出低、中、高三个不同浓度的质量控制样品（其QC浓度分别为4.00、50.00和1000.00 ng/mL）。储备液I以及标准系列溶液均置于4℃保存，并于使用前放置至室温。
2.1.2 西洛他唑内标溶液的配制 精密称取西洛他唑标准品10.1 mg，用甲醇∶水（50∶50，v/v）溶液精确定容于10 mL容量瓶中得到1.00 mg/mL的储备液I；精密移取9 μL内标储备液I，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀。获得浓度约为180 ng/mL的西洛他唑内标溶液。
2.2 检测条件
2.2.1 色谱条件的选择 流动相条件为：0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（60∶40，v/v）；流速为0.4 mL/min；色谱柱为Hypersil ODS-C18柱（100×2.1 mm，I.D. 5 μm，中国大连伊力特公司）；柱温为室温，进样量10 μL。
2.2.2 质谱条件的选择 电喷雾电离源（ESI），采用正离子模式扫描；离子喷射电压为4700 V；温度为570℃；扫描方式为多反应监测（MRM），乌苯美司 m/z 309.10→m/z 120.30、甲氨蝶呤m/z 455.20→m/z 308.20和内标m/z 370.40→m/z 288.10（各化合物的结构及产物离子见图1）；碰撞能量（CE）为32 eV（乌苯美司）、27 eV（甲氨蝶呤）和20 eV（内标IS）；扫描时间为150 ms。
2.3 血浆样品处理
实验前大鼠禁食过夜（不禁水）。实验时，先将大鼠麻醉，通过颈静脉注射给药后在不同时间点进行颈静脉取血。取血浆50 μL，加入50 μL甲醇和50 μL内标溶液（180 ng/mL），200 μL乙腈，涡旋混匀1 min；离心（16 099×g）10 min，取上清液于另一EP管中，37℃氮气流下吹干，残留物加入200 μL流动相复溶，15 000 r/min 离心10 min，取上清于进样小瓶中，10 μL进样分析。
2.4 方法专属性实验
取空白血浆50 μL加入100 μL甲醇，按“2.3”项下方法操作，得空白血浆样品色谱图（图2A）。取血浆50 μL，加入50 μL对照品溶液和50 μL内标溶液配制成相当于血浆浓度200 ng/mL的血浆样品，按“2.3”项下方法操作，得对照品色谱图（图2C）。给药30 min后的血浆处理进样得色谱图（图2D）。结果表明在选定色谱、质谱条件下，血浆内源性杂质对待测物无干扰，乌苯美司、甲氨蝶呤及内标物峰形良好，分离完全，保留时间分别为1.55 min、0.96 min和1.80 min。
2.5 标准曲线和定量下限的考察
取空白血浆50 μL，加入乌苯美司和甲氨蝶呤标准系列溶液50 μL，加入内标溶液50 μL，配制成相当于血浆浓度为2.00、5.00、20.00、50.00、200.00、500.00、2000.00 ng/mL的血浆样品，按“血浆样品处理”项下操作，每一浓度进行三样本分析，取10 μL进样分析。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权（w=1/x2）最小二乘法进行回归运算，求得的回归方程分别为Y1=0.00109c2+0.00173（r=0.9981）、Y2=0.00116c3+0.00378（r=0.9978）。结果表明，乌苯美司和甲氨蝶呤在2.00～2000.00 ng/mL范围内线性关系良好。取空白血浆50 μL，加入4.00 ng/mL 乌苯美司标准溶液50 μL，配制成相当于血浆浓度为2.00 ng/mL，在方法确证首天对该样品进行6样本分析，求出乌苯美司和甲氨蝶呤的日内精密度（RSD）为3.24和1.97，准确度（RE）为-2.5和-2.0。乌苯美司和甲氨蝶呤的定量下限是2.00 ng/ mL（见图2B）。
2.6精密度与准确度的考察
取大鼠空白血浆50 μL，配制低、中、高三个浓度（乌苯美司和甲氨蝶呤血浆浓度为4.00，50.00和1000.00 ng/mL）的质量控制（QC）样品，进行6样本分析，连续3 d测定，根据当天所配置的标准曲线，计算质量控制样品浓度，并进行方差分析，得出准确度和精密度（表1）。以上结果表明，对于检测生物樣品中乌苯美司和甲氨蝶呤的方法均精密、准确，符合有关国际规范的要求。
2.7 提取回收率与基质效应的考察
乌苯美司和甲氨蝶呤质控样品按“2.3”项下方法操作。进样得峰面积 A1；50 μL空白血浆加入 50 μL甲醇和200 μL乙腈沉淀蛋白，涡旋，14 000 r/min离心 10 min，取上清，氮气吹干，加入流动相配制的乌苯美司和甲氨蝶呤浓度为4.00、50.00和1000.00 ng/mL 的对照品溶液，混匀离心后取上清进样，得峰面积 A2；流动相配制的乌苯美司和甲氨蝶呤浓度为4.00，50.00和1000.00 ng/mL 的对照品溶液，进样得峰面积 A3。每个浓度平行做平行6样本分析。以A1/A2×100%计算得乌苯美司和甲氨蝶呤的提取回收率，以A2/A3×100%计算得到基质效应。低、中、高浓度质控样品的提取回收率均>94.53%，基质效应在 93.45% ～ 97.27%范围内，符合生物样品的分析要求（表 2）。
2.8 样品的稳定性考察
将乌苯美司和甲氨蝶呤的大鼠血浆样品置于室温2 h，处理后的乌苯美司和甲氨蝶呤的血浆样品置于室温24 h，经历3次冷冻-解冻循环以及血浆样品-20℃冷冻15 d，考察其稳定性。稳定性考察时，取大鼠空白血浆50 μL，按“2.3”项配制出乌苯美司和甲氨蝶呤的血浆样品，包含低、高两个浓度（血浆浓度分别为4.00和1000.00 ng/mL），每一种浓度水平的每一种稳定性考察进行三样本分析，采用LC-MS/MS法测定。结果表明乌苯美司和甲氨蝶呤的血浆样品室温放置2 h稳定（RSD<4.3）；处理后样品室温放置24 h稳定（RSD<6.2）；经历3次冷冻-解冻循环稳定（RSD<8.4）；血液样品-20℃冷冻15 d稳定（RSD<6.8）。
2.9 乌苯美司和甲氨蝶呤的大鼠体内胃肠道吸收的相互作用
实验前大鼠禁食过夜（不禁水）。戊巴比妥麻醉后，分别用大鼠灌胃器灌胃给药，然后在规定时间内进行颈静脉取血。实验分组及给药剂量如下：（1）乌苯美司（4 mg/kg，对照组）；（2）甲氨蝶呤（5 mg/kg，对照组）；（3）乌苯美司（4 mg/kg）+甲氨蝶呤（5 mg/kg）。在特定时间时测定乌苯美司和甲氨蝶呤的大鼠血药浓度-时间曲线（图3A、B）与药代动力学参数（表 3）。
3讨论
本实验采用LC-MS/MS法测定，其灵敏度好，准确度高；用MRM扫描方式，专属性强；采用氮气挥干的方法，不仅有效的将干扰组分排除，还是样品浓缩，大大增强乌苯美司和甲氨蝶呤痕量分析物的检出能力。本实验建立了快速、灵敏、高效的LC-MS/MS分析法，同时测定生物样品中的乌苯美司和甲氨蝶呤。此分析方法的定量下限均可达2.00 ng/mL，并根据大鼠灌胃给药后两药的的血药浓度变化分析药物相互作用。
临床上当同为P-gp和OATs底物的抗癌药物甲氨蝶呤和乌苯美司合用时，是否会发生由药物转运体所介导的药物相互作用有待研究[13-15]。基于这一构想，开展了本次实验研究。对药代动力学参数进行分析发现，甲氨蝶呤和乌苯美司同时灌胃给药与单独给药组相比，二者的血药浓度均升高，AUC分别由（38.40±0.70） min·μg/mL增加到（213.00±28.00） min·μg/mL（甲氨蝶呤）和（820.00±60.00）min·μg/mL增加到（1170.00±110.00） min·μg/mL（乌苯美司），二者的血浆清除率均显著下降（图 3A、B，表 3），提示同时给药后，二者在肠道吸收过程中存在相互影响，导致彼此进入血中的药物浓度增加，证明了二者在胃肠道存在相互作用的靶点，为药物转运体介导药物代谢与排泄的临床合理用药提供参考。
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（收稿日期：2016-08-28）