摘要：【目的】探讨重金属铜在鱼体内的蓄积情况，并从抗氧化酶活性强弱变化分析铜暴露对鱼体组织造成的损害及其规律，为发展罗非鱼健康养殖提供参考依据。【方法】分别设0（CK）、1.0、2.0、4.0和6.0 mg/L不同铜暴露浓度的养殖水体，进行为期40 d的暴露试验后，取罗非鱼的鳃、肝脏、肾脏、肌肉和肠道组织测定其铜离子含量和抗氧化酶活性。【结果】各铜暴露处理组罗非鱼的肝体比均显著高于CK组（P<0.05，下同）。在相同铜暴露浓度下，罗非鱼各组织富集铜离子的能力排序为肝脏>肠道>肾脏>鳃>肌肉。随着铜暴露浓度的升高，罗非鱼肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活性先降低后升高，而肾脏SOD活性先升高后降低；在不同组织中，以肾脏过氧化氢酶（CAT）活性最强，且随铜暴露浓度升高呈先升高后降低的变化趋势，在2.0 mg/L暴露浓度下其活性最强；丙二醛（MDA）含量在肝脏、肾脏中的变化规律与SOD活性一致，但转折的铜暴露浓度为4.0 mg/L。【结论】铜暴露能够使其富集在罗非鱼的不同组织中，其中以肝脏组织中的富集量最高，肌肉组织中的富集量较低，即对商品罗非鱼主要食用部分影响不明显。铜暴露对罗非鱼的毒害作用主要表现为肝脏和肾脏受损、体内代谢紊乱。
关键词： 吉富罗非鱼；铜；组织残留；抗氧化酶活性
中图分类号： S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）10-1784-06
0 引言
【研究意义】随着现代工业的发展，水体环境中重金属的残留水平也逐年增加。其中，铜及其化合物污染主要由铜锌矿的开采和冶炼、机械制造、塑料电镀铜化合物、金属加工等环节产生（Schnick，1988；潘科等，2014）。另外，硫酸铜是目前水产养殖中最常用的杀虫、除藻和消毒剂（罗福广等，2016），但盲目用药也可能毒死养殖鱼类或导致鱼类产品中重金属铜残留量超标。因此，探究重金属铜对鱼类组织产生的损伤程度及其累积规律，可为人工养殖鱼类产品质量安全控制提供理论依据。【前人研究进展】至今，有关重金属铜对鱼类养殖生产及养殖水体的影响已有较多研究报道。Pourang和Dennis（2005）研究发现，铜在虾体各组织内的积累差异明显，表现为内脏>鳃>肌肉。Hoyle等（2007）研究表明，基础饵料中添加过量铜会抑制革胡子鲶的生长发育。Wang等（2011）首次报道了由于铜污染出现的蓝牡蛎现象。崔欣（2013）研究表明，日粮中添加高浓度的铜离子会降低吉富罗非鱼的存活率、摄食量和增重，但对其消化功能无明显影响；此外，高铜处理组吉富罗非鱼的肝脏铜离子累积量最高，其形态结构也出现相应的病变。种香玉（2014）通过对比研究高浓度铜饵料对不同食性鱼的影响，结果显示，草食性鱼类对铜代谢较好、耐受性较强，杂食性次之，肉食性最差。综上所述，铜暴露一段时间后，会对机体的组织造成一定损伤，可降低肝脏中的酶活性，促进脂质过氧化作用从而形成脂肪肝（Liu et al.，2010）；并形成病理损伤，主要表现为组织细胞变性、裂解、坏死、溶解、肿大或增生，且毛细血管扩张充血（王利和汪开毓，2008，2009）。重金属铜在机体肝脏、鳃、肾脏、肌肉和肠道组织中的积累，尤其在肌肉中的积累与食品安全及人体健康息息相关。【本研究切入点】目前，我国已成为世界上最大的羅非鱼生产国与出口国，而广西作为我国罗非鱼的主产区，其产业潜力巨大、增长迅猛，具有其他省份无法比拟的优势，但有关重金属铜暴露对罗非鱼组织残留及抗氧化酶活性的影响研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】将吉富罗非鱼长时间暴露在不同铜浓度水体中，探讨铜在鱼体内的蓄积情况，并从抗氧化酶活性强弱变化分析铜暴露对鱼体组织造成的损害及其规律，以期为发展罗非鱼健康养殖提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验用鱼为吉富罗非鱼（GIFT tilapia），取自广西水产科学研究院武鸣基地，平均体重180±20 g。试验前暂养1周，使其适应实验室内的养殖环境。铜暴露浓度设0（CK）、1.0、2.0、4.0和6.0 mg/L 4个处理组，每组60尾罗非鱼（雌雄各半）。
1. 2 饲养管理
各处理组罗非鱼每天投喂2次，投喂量为鱼体重的3.0%～3.5%，投喂后及时清理粪便和残饵。在整个试验期间，每隔3 d换水1次，换水量为2/3，养殖用水为曝气后调过铜离子浓度的自来水，pH 7.0～7.8、溶解氧为5.5 mg/L、水温（29±1）℃。试验开始40 d后，分别随机选取雌、雄鱼各6尾进行取样（鳃、肠道、肝脏、肾脏和肌肉），用于测定铜离子含量和抗氧化酶活性。所有罗非鱼在试验结束时均测量全长、体长和肝重，并计算其肝体比（肝脏重量/体重）。
1. 3 铜离子残留测定
称取各组织样品1.0 mg，加入1.0 mL硝酸（65%～ 68%）在EP管中硝化24 h；然后将硝化液转移至石英试管中，加超纯水定容至3.0 mL，放入石墨消解仪（超纯水120 ℃硝化）；中途加0.5 mL H2O2以加快消解进程，并根据反应程度决定其添加次数（H2O2≥30%），直至液体清亮透明，无其他杂物，取出冷却后加超纯水定容至10.0 mL。静置过夜，再用ICP-MS质谱仪测定组织样品的铜离子含量。
1. 4 抗氧化酶活性测定
按9∶1比例向各组织样品（肝脏、肾脏、鳃和肠道）中加入PBS，组织匀浆后3000 r/min离心30 min，取上清液，然后测定各组织中的抗氧化酶活性。抗氧化酶活性测定步骤：①制作标准曲线；②加样：设置空白孔（不加样品和酶标试剂）、待测样品孔（每孔先加40.0 μL样品稀释样和10.0 μL待测样品，混匀）；③温育：盖上封板膜，置于37 ℃恒温箱内温育30 min；④洗涤：揭掉封板膜，甩掉液体，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃除，反复5次，拍干；⑤加酶：每孔加50.0 μL酶标试剂，空白孔除外；⑥再温育：同③；⑦再洗涤（分离游离的和结合的酶标记物）；⑧显色：每孔先加显色剂A 50.0 μL，再加显色剂B 50.0 μL，混匀后温育15 min；⑨终止：每孔加终止液50.0 μL（颜色由蓝变黄）；⑩测定：用酶标仪在450 nm处测定吸光值，要求在加入终止液后15 min内完成测定。
2 结果与分析
2. 1 不同铜暴露浓度下罗非鱼的生长状况
由表1可以看出，在不同铜暴露浓度养殖水体中，罗非鱼的各项生长指标无显著变化（P>0.05，下同），但各铜暴露处理组罗非鱼的肝体比显著高于CK组（P<0.05，下同），说明水体中铜离子对罗非鱼肝脏有显著影响。
2. 2 铜离子在罗非鱼各组织中的残留量
在相同铜暴露浓度下，罗非鱼各组织的铜富集能力排序为肝脏>肠道>肾脏>鳃>肌肉。其中，铜离子在肝脏组织中的积累量最高，肌肉组织中的积累量最低。不同铜暴露浓度下，铜离子在罗非鱼各组织中的残留趋势相似，但以铜暴露浓度为4.0 mg/L时最明显（图1），该浓度下除鳃和肌肉组织间的铜离子残留量无显著差异外，其他组织间的铜离子残留量均存在显著差异。
在相同的暴露时间下，各铜暴露处理组与CK组罗非鱼肌肉组织中的铜离子积累量差异不显著；而在其他组织中，各铜暴露处理组的铜离子积累量均显著高于CK组（图2）。
2. 3 铜离子对罗非鱼各组织酶活性的影响
罗非鱼暴露在铜离子水体中，其肝脏超氧化物歧化酶（SOD）活性均比CK组低（除6.0 mg/L），且以2.0 mg/L暴露浓度下的SOD活性最低，与CK组及6.0 mg/L组间存在显著差异；肾脏SOD活性则以2.0 mg/L暴露浓度组最高，与CK组及1.0 mg/L暴露浓度组间存在显著差异；而肠道和鳃组织的SOD活性变化规律不明显（图3）。
罗非鱼暴露在铜离子水体中，其肾脏过氧化氢酶（CAT）活性最强，且以2.0 mg/L暴露浓度下的肾脏CAT活性最高，与CK组的差异显著；肝脏CAT活性以6.0 mg/L暴露浓度组最高，显著高于其他暴露浓度组及CK组；鳃组织CAT活性以6.0 mg/L暴露浓度组最低，显著低于其他铜暴露浓度组；各处理组的肠道CAT活性差异不显著（图4）。
在罗非鱼肝脏内，随着铜暴露浓度的升高，丙二醛（MDA）含量呈先降低后上升的变化趋势，以4.0 mg/L暴露浓度下的肝脏MDA含量最低，与CK组及1.0、6.0 mg/L暴露浓度组差异显著；而鳃组织中以4.0 mg/L暴露浓度组的MDA含量最高，显著高于6.0 mg/L暴露浓度组；各处理组的肾脏和肠道MDA含量无显著差异（图5）。
3 讨论
《中国渔业生态环境状况公报》规定标准ρ（Cu2+）不能超过0.01 mg/L，但随着工业的发展，水体环境中的铜离子浓度已超过该标准（刘胜玉等，2014；潘科等，2014）。水生动物长期生活在铜离子超标的水体中，其正常活动会受到明显影响。肝脏是机体摄食毒物后的主要解毒和排毒器官（高春生等，2008），当其生活在铜暴露水体中，肝脏中就会积累高浓度的铜离子。肝体比在不同鱼类及其不同健康状况下会增大或减小，且已有研究表明肝体比和肝脏代谢呈正相关（Stephensen et al.，2000）。本研究结果表明，罗非鱼在铜暴露水体环境下，其肝脏明显变大，说明肝脏代谢已受到严重影响。
不同鱼类及同种鱼类不同部位对重金属的富集能力也不同，会随暴露接触时间的延长而增加，一般在40～50 d达到平衡（孟晓红等，2000）。马桂云等（2007）研究发现，铜在鲫鱼各组织内的富集能力差异明显，其中以内脏的富集能力最强，而肌肉的富集能力最弱；李湘萍等（2011）研究表明，铜在对虾肝胰腺中的积累最多，在肌肉中的积累最少；崔欣（2013）研究表明，鱼体内肝脏组织对铜离子的富集能力最强，而肌肉组织的富集能力最弱。本研究发现，铜离子在吉富罗非鱼体内的富集量依次为肝脏>肠道>肾脏>鳃>肌肉，与崔欣（2013）的研究结果一致。此外，随着铜暴露浓度的升高，罗非鱼各组织中累积的铜离子含量也随着升高。
SOD是唯一直接以自由基为底物的抗氧化酶，能催化超氧化物阴离子自由基（ ）发生歧化反应，从而消除细胞内过多的 ，以减轻对细胞的损伤程度（Silvestre et al.，2006）。本研究結果显示，罗非鱼肾脏SOD活性先升高后降低，在2.0 mg/L暴露浓度下其活性最高；肝脏SOD活性随铜暴露浓度升高呈先降低后升高的变化趋势，在2.0 mg/L暴露浓度下其活性最低。杨丽华等（2003）研究发现，SOD清除 的能力与其含量及活性有关，当受到轻度胁迫时SOD活性升高，但受到重度胁迫时SOD活性降低。本研究中，罗非鱼肾脏的SOD活性变化规律与杨丽华等（2003）的研究结果一致，说明铜暴露对肾脏组织已造成损害，导致SOD活性降低。
CAT的主要作用是将H2O2氧化成H2O和O2（刘冰，2007）。肾脏中因SOD结合自由基产生的H2O2最多，故CAT活性强度最强。钱晓薇（2005）研究发现，铜对黄鳝CAT活性有明显的影响，且呈双向性；王凡等（2008）研究发现，水体铜暴露对牙鲆鳃的CAT和SOD活性均有低浓度诱导和高浓度抑制的作用；刘香江（2010）研究表明，矛尾复虾虎鱼肝脏的SOD和CAT活性随着铜暴露浓度的升高而显著降低。在本研究中，罗非鱼肾脏CAT活性呈先升高再降低的变化趋势，在2.0 mg/L暴露浓度下其活性最高。肾脏中CAT活性与SOD活性的变化趋势基本一致，均随水体中铜暴露浓度的增加呈先增强后减弱的变化趋势，表明进入罗非鱼体内的铜离子产生大量自由基而未能及时被清除，最终发生氧化损伤。
自由基对鱼体产生毒性是通过脂质过氧化产生MDA，生成的MDA与蛋白质游离氨基产生作用，进而对细胞产生损害。已有研究表明，铜中毒会引起体内MDA含量升高（Chandran et al.，2005）。本研究结果表明，肾脏中的MDA含量在一定铜暴露浓度下随着浓度的升高而升高，但超过4.0 mg/L后反而降低；肝脏内的MDA含量则相反，呈先降低后上升的变化趋势，以4.0 mg/L暴露浓度下的肝脏MDA含量最低。MDA含量在肾脏中随铜暴露浓度的升高而升高，而在肝脏中随铜暴露浓度的升高而降低，可能与铜离子在这两个组织内累积程度不同有关，但具体原理有待进一步探究。
4 结论
铜暴露能够使其富集在罗非鱼的不同组织中，其中以肝脏组织中的富集量最高，肌肉组织中的富集量较低，即对商品罗非鱼主要食用部分影响不明显。铜暴露对罗非鱼的毒害作用主要表现为肝脏和肾脏受损、体内代谢紊乱。
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（責任编辑 兰宗宝）