罗非鱼细菌性败血症的防控途径探索

疫情会有所改善，发病率最高的水温为25～32 ℃[2]。

2 疾病诊断

2.1 初步诊断

罗非鱼细菌性败血症的主要特征表现为鱼群大量聚集在池塘出水口缓缓游动、食欲不振、鱼体色发黑等。其中，眼眶、背部、鳃盖、腹鳍和胸鳍等部位均会出现上述症状。鱼体发病后，可见肛门红肿和体表粘液增多等特征。镜检证实病鱼体表黏液、鳃等患病部位无寄生虫，鱼体解剖可见腹腔内出现大量腹水，鳃盖内缘出血，且肠腔、肠道内无食物。病鱼肝脏可见暗红色或是土黄色，部分病鱼腹部或是肝脏部位可见病灶出血症状。养殖水体理化指标检测结果证实：pH值为7.4、亚硝酸盐偏高、氨氮偏高、水温26.8 ℃[3]。

2.2 实验室分离、纯化与鉴定

使用70%浓度的酒精消毒病鱼胸腹部，随后使用无菌蒸馏水进行3次洗涤;由肛门处打开一个切口，从腹部左侧和右侧分别向上剪去胸腹壁，保证鱼体内的脏器充分暴露;再使用70%浓度的酒精消毒鱼体脏器，使用无菌水进行彻底冲洗;通过灼烧后冷却的接种环，由肝、脾和肾等部位分别蘸取组织，再分别接种至普通营养琼脂培养基上;将培养基置于生化培养箱内，以30 ℃的温度进行24 h培养。结果证实，鱼体肝、脾、肾等部位均出现菌落，且菌落特征表现为淡黄色或无色的圆整、光滑以及微凸形态，且伴有芳香的气味。使用湿润、圆形以及中等大小的单个菌落，分别进行2～3次分离培养。纯化处理后的菌株置于30%的甘油中，并在-70 ℃冰箱中保存，待后续鉴定。菌落大小因培养时间温度而异，直径过大的菌落不会产生色素[4]。

通过梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统实施病原菌鉴定。结果证实，嗜水气单胞菌是最主要的病原菌类型，其pH值为6～11，7.27为最适宜的pH值环境。嗜水气单胞菌适应的水温范围在14～40 ℃，最适宜的温度是28～30 ℃，因而夏秋季节的嗜水气单胞菌繁殖率最高，通常每15～20 min为一个繁殖周期。嗜水气单胞菌属于一种条件致病菌，通常可在养殖环境中广泛分布。若鱼体的养殖环境理化条件改变或是生理状态改变，则会诱发嗜水气单胞菌感染类疾病。嗜水气单胞菌能够产生较强的外毒素作用，进入鱼体后会在肠道内增殖，并由门动脉进入肾脏、肝脏等组织，最终诱发血液系统疾病或是肝脏、肾脏等器官疾病[5]。

3 细菌培养

通过平板稀释培养法进行嗜水气单胞菌筛选培养，选择适当颜色、透明度、光泽、表面结构、边缘形状、形状和大小的微生物菌落，挑选后编号。将所选菌落置于PDA培养基上，并在28 ℃条件下培养4天。以嗜水气单胞菌HCLF-2为指示菌，通过抑菌圈法进行嗜水气单胞菌抑菌菌株的培养和保存。从拮抗菌株的培养特征来看，它具有最强的拮抗性，在蔗糖察氏、燕麦、无机淀粉、马铃薯以及葡萄糖酵母膏培养基中接种，并保存在28 ℃环境下进行3～7 d培养。从结构可知在不同培养基上的生长形态、基内菌丝、气生菌丝及色素。使用纤维素水解、明胶液化、碳源利用、淀粉水解和H2S产生等试验进行生理生化特征的鉴定。将菌株LFJK-11接种在LB培养基中，连续连续12～18 h的震荡培养，提取基因组DNA，并以DNA组为模板，对16SrDNA基因扩增通用引物进行PCR扩增处理，结构可见16SrDNA。其中，引物序列为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。用1%瓊脂糖凝胶进行电泳分离，用DNA胶回收试剂盒纯化，然后直接寄至上海生工测序部进行测序。将测序结果在NCBI上进行比对分析，筛选出9株菌株16SrDNA的全序列，使用ClustalW软件构建系统进化树。

拮抗检测筛选可见1株对嗜水气单胞菌HCLF-2具有一定拮抗作用的菌株，编号为LFJK-11，抑菌圈直径为15.6 mm[6]。如表1所示，LFJK-11菌株的拮抗作用对于大肠杆菌、黑霉菌、金黄色葡萄球菌以及苏云金杆菌的效果均较为理想，且其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，而对黑霉菌的抑制作用相对较差。发酵液稀释30～60倍，它的拮抗作用仍然较为显著，说明该菌株的发酵性能良好[7]。通过划线法分别在菌株上接种蔗糖察氏、燕麦、无机淀粉、马铃薯和葡萄糖酵母膏，并在28 ℃环境下连续培养7天。结果证实，葡萄糖酵母膏培养基上的菌株生长最好，生长速度较快，菌落较大，边缘呈放线状向外扩散，表面干燥有突起，孢子呈圆形，具有土腥味。

4 防控措施

4.1 预防措施

1）彻底清洗和消毒鱼塘。将鱼塘内的淤泥彻底清除，是预防罗非鱼细菌性败血症的最有效措施。具体地，可在冬季彻底清理鱼塘后，喷洒漂白粉或是生石灰进行消毒，调节水体环境。2）水体消毒。在鱼塘内喷洒生石灰，剂量为20～30 g·m-3，以改善水质环境，调节水体的含氨氮量[8]。3）内服预防。高温季节在每100 kg饲料中加入30 g维生素E和50 g稳定性维生素C，以增强罗非鱼的抗病能力。4）日常饲养。养殖户应掌握科学养殖的措施，避免投喂变质的饲料，保证鱼体自身的抗病能力。5）注射疫苗。鱼种养殖前可浸泡或注射嗜水气单胞菌疫苗，并保证用法正确[9]。

4.2 治疗措施

1）全面喷洒6.6%以上的二氧化氯，剂量为0.20～0.29 g·m-3。若病情较为严重，可每2天使用1次，也可连续3～5 d投喂0.10～0.15 g·kg-1鱼的氟苯尼考粉，若病情严重可延长用药周期。2）全面泼洒50～100 mg·m-3的苯扎溴铵，连续使用2次，也可内服0.1 g·kg-1鱼的磺胺药[10]。

5 结语

导致罗非鱼发生细菌性败血症的原因包括环境因素、季节因素以及鱼体自身因素等，因而需要从鱼苗选择、环境改善和细菌监测方面着手进行综合防治，采取全面的防控措施，降低细罗非鱼菌性败血症的发生率。

参考文献：

[1] 李梦茜，张振旺.罗非鱼细菌性败血症病原菌嗜水气单胞菌拮抗菌株的筛选和鉴定[J].江苏农业科学，2017，45（3）：129-130.

[2] 韓殿峰，邹荣婕，宋译，等.丁香酚在罗非鱼血浆中药代动力学研究[J].食品安全质量检测学报，2019，10（8）：2190-2191.

[3] 沈涛，沈艺敏，李仁焕.饲料脂肪水平对红罗非鱼稚鱼生长及血液生化指标的影响[J].饲料研究，2019，5（9）：15-16.

[4] 张聪，朱照华.裹浆的组成与黏度对裹面包屑罗非鱼片品质影响的研究[J].中国食品添加剂，2019，7（5）：55-56.

[5] 雷燕，肖洋，赵振锋，等.罗非鱼罗湖病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].广东海洋大学学报，2019，39（3）：1-2.

[6] 韦阳道，杨军，文衍红，等.罗非鱼竖鳞病病原维氏气单胞菌的分离鉴定与致病性研究[J].中国畜牧兽医，2016，43（11）：3047-3052.

[7] 李聪，蔡岩，周永灿，等.海南罗非鱼致病性维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究[J].水产科学，2015，34（10）：640-646.

[8] 陈善真，潘忠超，段元慧，等.一株尼罗罗非鱼致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J].广东农业科学，2014（7）：158-161.

[9] 张栋，庞纪彩，高风英，等.3个不同尼罗罗非鱼（Oreochr-omis niloticus）群体MHC IIA基因多态性和遗传分化[J].基因组学与应用生物学，2019，38（4）：1532-1533.

[10] 林雪，段静娜，赵玉蓉，等.不同组成酸化剂对罗非鱼生长性能和抗氧化及肝脏代谢酶活性的影响[J].饲料工业，2019，40（8）：51-52.

（责任编辑：赵中正）

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