摘要：将尾叶按(Eucalyptus urophylla)叶片在液氮中研磨成粉，先用含山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白、聚乙二醇和亚精胺的提取缓冲液使总核酸沉淀，同时去除了大部分次生代谢物质。然后用山梨醇、月桂酰肌氨酸钠进一步裂解细胞，释放核酸。再用CTAB与核酸结合成复合物溶于高盐溶液。用氯仿／异戊醇除蛋白质后，离心得含总核酸的上清液。运用钙盐分步沉淀法，先在上清液中加入1／10体积的10％氯化钙溶液，使DNA与Ca2+结合成DNA钙盐。向溶液中加入1／5体积的乙醇，使DNA钙盐形成沉淀析出，离心得DNA后，再增大乙醇浓度使RNA钙盐沉淀。得到的DNA和RNA用非变性琼脂糖凝胶进行质量检测，可得完整的RNA和DNA条带。此法经济、快捷，可同时得到DNA和RNA。
关键词：木本植物；RNA；DNA；非变性琼脂糖电泳
中图分类号：075 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2010)04-0773-03
木本植物的组织中含有较多的多糖及单宁、酚、醌、原花色素类物质等次生代谢物质。这些物质严重影响木本植物RNA和DNA提取效率，甚至造成提取失败而成功提取高质量的RNA和DNA是进行分子生物学研究的必要前提，如Nofthera杂交分析、cDNA文库构建、RT—PCR、Southern杂交分析等实验都需要高质量的RNA或DNA。常用于植物RNA或DNA提取的方法有异硫氰酸胍法、热硼酸法、CTAB法、SDS法等。这些方法对于某些植物的核酸提取是有效的，但对另外一些植物来说，却并不一定是好的方法。对于木本植物而言。由于其次生代谢物质含量丰富，这些物质的化学性质又与核酸相似，所以提取过程中，次生代谢物质会严重干扰核酸的提取，影响核酸的得率及质量，甚至导致提取失败。
目前，常规的核酸提取方法或使用的试剂盒大多是针对单独的RNA或DNA的提取。用常规方法常易失败，而试剂盒不仅价格昂贵，而且适用于木本植物的试剂盒更是很少。
目前，文献中还没有报道用同一材料同时得到分离的RNA和DNA用于不同方面研究的报道。本研究以此为出发点，尝试从木本植物中同时得到分离的RNA和DNA，并通过琼脂糖电泳检测所提核酸的完整性。
1 材料与方法
1.1 植物材料
尾叶桉新鲜叶片。
1.2实验试剂
提取缓冲液：50 mmol／L Tris(pH值8.0)、35mmol／L山梨醇、5 mmol／L EDTA、10％(W／V)聚乙二醇4000、5％(W／V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.2％(W／V)亚精胺和0.1％(W／V)牛血清白蛋白。洗涤缓冲液：50mmol／L riffs(pH值8.0)、35mmol／L山梨醇、25 mlil01／L EDTA。氯仿／异戊醇(24：1，V／V)、10％(W／V)月桂酰肌氨酸钠、5m01／L NaCl、含NaCl0.7mol／L的10％(W／V)CTAB、无水乙醇、70％乙醇、IO％CaCl2、TE或无菌水、1xTBE、Gold View核酸染料。
1.3 RNA和DNA的提取
称取约100mg新鲜尾叶桉叶片，在液氮中研磨成细粉后转移到2mL的离心管中：加入1.5mL提取缓冲液，颠倒混匀，3 000xg离心10 min；去上清，将沉淀悬浮于0.5 mL洗涤缓冲液中，依次加入10％月桂酰肌氨酸钠150 o,L、5 mol／L NaCl 150 txL、8.6％(W／V)CTAB和0.7 mol／L NaCl 200 IxL，混匀后65℃水浴20-30min；取出离心管自然冷却，加入l mL氯仿／异戊醇(24：l，V／V)混匀、静置5 min后，14 000xg离心10min；转移上清至新管，加入1／10体积的10％氯化钙溶液。混匀后静置5 min，再加入1／5体积无水乙醇静置10min后，12 000xg离心5rain；将上清转移至新管，DNA沉淀暂时保存。向上清中加入1.7倍体积的无水乙醇，静置20 min，12000xg离心5min。去上清，得RNA沉淀；分别用l mL 70％的乙醇洗涤上述沉淀，12 000xg离心5min。去上清，在超净工作台上晾干后加20μL TE溶解。CTAB法提取核酸参照王关林等的方法。TaKaRa公司RNiso试剂提取RNA方法参照说明书进行。叶片用量都为100 mg，最后都加20μrL TE溶解。
1.4 RNA和DNA电泳检测
配制1.0％琼脂糖凝胶，按100mL加入5μL的比例添加Gold View核酸染料。上样量2μL。电泳缓冲液为1xTBE，5V／cm恒压电泳1 h。电泳结束后在紫外灯下用数码相机照相。
2 结果与分析
非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA和DNA的质量，结果如图1所示。泳道1中DNA条带亮度低，RNA呈扫帚状，无明显条带。说明CTAB法很难从富含多酚的木本植物中提取核酸。泳道2为本方法提取的总核酸，DNA条带亮度高，RNA可见有明显的28S、18S和5.8S rRNA条带，且28S条带的亮度约为18S条带亮度的两倍。说明此方法得率高，RNA完整、无明显降解。泳道3为本方法从总核酸中沉淀的DNA。与总核酸泳道(泳道2)中的DNA相比，条带亮度减弱，说明DNA沉淀不完全。但泳道中无RNA片段，说明DNA从总核酸中完全分离，纯度高，无RNA污染。泳道4为本方法从总核酸中沉淀的RNA。与总核酸泳道(泳道2)中的RNA条带相比，条带亮度减弱，说明RNA沉淀不完全。同时，泳道中仍有极少的DNA，进一步证实了分步沉淀时，DNA没有完全沉淀出来。但泳道4中28S、18S和5.8S rRNA条带明显可见，证明提取的RNA降解少，片段完整。泳道5为用专门的木本植物RNA提取试剂RNiso提取得到的RNA，其带型及亮度与泳道4几乎完全相同，也有少量残留的DNA，说明此试剂提取RNA的得率和纯度与本方法一样。
3 讨论
本方法从木本植物桉树叶片中同时分离得到了RNA和DNA，并用非变性琼脂糖电泳检测了所提核酸的完整性。常规的RNA提取方法，如异硫氰酸胍法、RNiso试剂法，不仅需要苛刻的实验条件，而且所用的试剂含有重金属、酚、胍、强变性剂等污染环境的物质。另外，实验花费也相当大。本方法用常规试剂可以从木本植物中同时分离到完整的RNA和DNA，总核酸降解少，提取效率较高。虽然RNA中有少量DNA污染，但这是专业试剂也难以避免的现象，可通过加入DNase除去。本方法经济快捷，又避免了使用β-巯基乙醇、DEPC、溴化乙锭和甲醛等毒性大的试剂，减少了对实验操作人员的毒害及对环境的污染，具有较好的经济效益、生态效益和开发前景。