摘要：褐环乳牛肝菌作为针叶树种上重要的外生真菌，为宿主植物提供营养元素和水分，在此过程中，对于该菌分泌蛋白发挥的作用机制尚不清楚。利用SignalP、ProtComp等预测程序对褐环乳牛肝菌中18 303条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻，明确其含有327个分泌蛋白，同时，对上述分泌蛋白的氨基酸大小分布、信号肽长度、信号肽切割位点等进行分析，明确该菌分泌蛋白的氨基酸长度集中于51～450 aa，信号肽长度以17～21 aa的序列最为集中，其信号肽切割位点均属于A-X-A类型。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了褐环乳牛肝菌分泌蛋白的预测，分泌蛋白的信号肽切割位点类型与其他已经报道的致病疫霉、粗糙脉孢霉、禾谷炭疽菌等分泌蛋白信号肽切割位点一致。研究结果为进一步解析分泌蛋白在该菌为宿主植物提供营养过程中发挥的作用机制提供重要的理论支持。
关键词：褐环乳牛肝菌；全基因组；分泌蛋白；信号肽；预测程序
中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0045-04
E-mail：hanchangzhi2010@163.com。褐环乳牛肝菌（Suillus luteus），别称褐环黏盖牛肝菌、黄黏团子、土色牛肝菌等。目前，对该菌的研究主要集中在发酵生物学[1]、发酵条件[2]、培养条件[3]方面，以及其对樟子松、油松苗的促生作用[4]和与木霉协同促进红皮云杉苗木抗逆增效作用[5]等方面，此外还有过量钠盐、碱性pH值[6]和平菇汁[7]、接种量[8]对其生长影响及pH值对其三羧酸循环、草酸分泌及代谢途径中关键酶活性影响[9-10]等方面。作为针叶树种的重要外生菌根菌之一，褐环乳牛肝菌在提高根系对磷元素和水分的吸收方面发挥着重要作用[11]，然而，在此过程中，该菌中分泌蛋白所发挥的作用机制尚不清楚。
真菌中分泌蛋白一般具有N-端含有信号肽、无跨膜结构域、无糖基磷脂酰肌醇化蛋白（GPI）锚定位点以及没有将蛋白输送至线粒体或其他胞内细胞器的预测定位信号等4个基本特征。前人基于上述特征，对黄孢原毛平革菌[12]、结核分枝杆菌[13]、酿酒酵母[14]、根癌土壤杆菌[15]、禾谷镰刀菌[16]、粗糙脉孢菌[17]、稻瘟菌[18]、大丽轮枝菌[19]、致病疫霉[20]、米曲霉[21]、禾谷炭疽菌[22]等分泌蛋白进行生物信息学预测。然而，对褐环乳牛肝菌分泌蛋白的研究尚未见报道，随着S. luteus UH-Slu-Lm8-n1全基因组序列的释放[23]，为开展该菌分泌蛋白的预测提供了数据支持。本研究以S. luteus蛋白数据库中的18303条序列为基础，利用SignalP、ProtComp等预测程序对分泌蛋白进行找寻，以期进一步解析分泌蛋白为宿主植物提供营养方面的功能研究打下坚实的理论基础。
1材料与方法
1.1褐环乳牛肝菌数据来源
S. luteus的全基因组序列来源于NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Suillus）。
1.2分泌蛋白确定方法
参照前期对禾谷炭疽菌分泌蛋白的预测方法进行[22]。具体而言，利用SignalP v3.0[24]获得N端具有信号肽的蛋白序列，并利用ProtComp v9.0[25]实现上述蛋白的定位；再通过TMHMM v2.0[26]对蛋白的跨膜结构域进行预测，并利用 big-PI Fungal predictor在线分析实现蛋白脂质锚定修饰（glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins，简称GPI）的预测[27]；最后，利用TargetP v1.1[28]实现非胞外分泌蛋白的排除，最终明确S. luteus中的分泌蛋白。
1.3分泌蛋白信号肽酶识别位点预测
利用LipoP v 1.0[29]预测S. luteus中分泌蛋白的信号肽酶识别位点。
2结果与分析
2.1褐环乳牛肝菌中分泌蛋白的预测
S. luteus中含有18 303个蛋白质序列，其中，氨基酸长度最小的蛋白为49 aa，最大的为5 054 aa，蛋白多分布在800 aa以下，有16 966个，比例高达92.70%，尤以分布在51～100 aa 的蛋白数量最多，为4 088个，比例为22.34%。而高于1 000 aa的蛋白，数量较小，比例为1.93%（图1）。
首先，对上述18 303个蛋白序列进行信号肽预测，发现 1 083 个蛋白具有信号肽序列；其次，对上述蛋白进行亚细胞定位预测，发现有378个蛋白分泌至胞外，705个蛋白质并不分泌到胞外，其中299个蛋白转运至细胞质膜，151个蛋白传输至线粒体，104个蛋白转運至内质网，58个蛋白转运至高尔基体，30个蛋白转运至液泡中，25个蛋白转运至溶酶体中，而转运至细胞质、细胞核以及过氧化物酶的蛋白质总共有38
个；再次，对上述序列进行跨膜结构域分析，发现有290个蛋白不含有跨膜结构域，有88个蛋白含有不同数量的跨膜结构域，其中，含有1个跨膜结构域的蛋白数量为77个，含有2个跨膜结构域的蛋白数量为8个，含有3个跨膜结构域的蛋白数量为3个。结合前期分析结果，将290个不含跨膜结构域的推测蛋白和77个含有1个跨膜域的蛋白，合计367个蛋白均初步推断为分泌蛋白，继而进行后续GPI锚定蛋白的预测；接下来对上述序列进行GPI锚定蛋白预测，发现23个蛋白是GPI锚定蛋白，334个蛋白序列不具有GPI锚定位点，还有10个序列小于55个氨基酸残基未能进行分析；最后，利用TargetP对344个非GPI锚定的蛋白进行分析，发现327个蛋白含有胞外定位信号，14个蛋白含有线粒体目标肽，3个蛋白含有其他定位信号。通过上述分析，最终获得327个具有4个典型特征的分泌蛋白。
2.2褐环乳牛肝菌分泌蛋白氨基酸长度及信号肽特征
通过对327个分泌蛋白进行氨基酸大小分析，发现这些分泌蛋白在51～100 aa的数量最多，比例最大，为26.30%，其次为101～150 aa的分泌蛋白，比例为16.51%（图2）。通过对不同长度的氨基酸进行分析发现，尤以450 aa以下的分泌蛋白所占比例较高，为80.12%。结果表明，分泌蛋白多属于小型蛋白，其所含氨基酸长度一般较小，这与前期研究得出的禾谷炭疽菌[22]、樟疫霉[30]等病原菌分泌蛋白特征相一致。
对上述分泌蛋白所含信号肽进行氨基酸长度分析，发现含有信号肽长度为17～21 aa的蛋白质数量最多，比例为6391%，其中尤以所含信号肽长度为19 aa的蛋白序列居多，比例为16.82%（图3）。另外，利用LipoP对上述分泌蛋白进行信号肽酶识别位点的预测分析，发现244个蛋白序列含有SPⅠ型信号肽识别位点，5个含有SPⅡ型信号肽识别位点，比例分别为74.62%、1.53%，说明S. luteus中的分泌蛋白大部分是由SPⅠ型信号肽酶进行识别，从而切除信号肽的。
此外，通過对S. luteus分泌蛋白信号肽的切割位点 -3～+3 位进行统计分析，发现位于-3位、-2位、-1位、1位、2位、3位最多的氨基酸分别为A（丙氨酸）、S（丝氨酸）、A、A、P（脯氨酸）、V（缬氨酸）/T（苏氨酸）（表1）。因此，位于信号肽切割位点之前的氨基酸组成为ASA，属于AXA类型，为SPⅠ型信号肽识别位点，与通过LipoP预测的结果相一致，同时，也与前人通过对粗糙脉孢菌[17]、马铃薯晚疫病菌[20]、禾谷炭疽菌[22]等分泌蛋白具有的信号肽的酶切位点类型报道一致。上述结果表明，无论是植物病原菌，还是植物共生菌，对于分泌蛋白进行信号肽序列识别、切割的信号肽酶类型多为Ⅰ型。
3讨论与结论
随着S. luteus全基因组序列的公布，为深入解析其基因功能的研究提供了重要的数据基础。云南松（Pinus yunnanensis）是我国西南地区尤其是云南省境内重要的建群树种，也是该地区的荒山绿化造林先锋树种，其面积、蓄积量分别占云南省林地面积、蓄积量的29.2%、15.8%[31-34]。作为该树种上重要的外生菌根菌，S. luteus在营养元素利用和水分吸收方面发挥着重要作用。据报道，宿主植物中约20%的净初级生产力将传递给外生菌根[35]，其生物量在温带森林中约占土壤微生物总生物量的30%[36]。
植物与病原菌互作过程中，病原菌为了实现在植物中定殖、扩展等过程，利用分泌蛋白实现其致病、生长等生理过程。然而，对于外生菌根菌分泌蛋白在营养元素利用和水分吸收方面所具有的功能，尚不明确。本研究发现S. luteus中存在327个具有典型特征的分泌蛋白，与前期获得的禾谷炭疽菌[22]、樟疫霉[30]的分泌蛋白数量相比，明显较少，是否是由于该菌不是致病菌，致使其所具有的参与植物体内定殖、扩展相关的分泌蛋白退化所造成的，有待于今后进一步得以明确。就S. luteus分泌蛋白所具有的氨基酸长度而言，多集中于 51～450 aa之间，比例为80.12%；就分泌蛋白所具有的信号肽长度而言，多集中于15～28 aa之间，比例高达94.19%，上述特征与致病菌分泌蛋白所具有的特征相似。
本研究基于S. luteus蛋白质数据库中的18 303条序列，利用SignalP、ProtComp、TMHMM、big-PI Fungal Predictor和TargetP等预测程序总共获得327个分泌蛋白，明确该数量明显低于致病菌的分泌蛋白数量，同时，通过对上述分泌蛋白进行氨基酸长度、信号肽长度以及信号肽酶切位点等方面的研究，发现上述分泌蛋白属于小型蛋白，其信号肽长度多集中于17～21 aa，同时发现真菌信号肽的酶切位点类型具有保守性特点。本研究为深入开展S. luteus中的分泌蛋白功能研究打下了一定的理论基础。
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