抗病小黑麦异染色体系的创制与鉴定

规范和数据标准》[6]，对株高、穗长、芒、株型和穗型等主要农艺性状进行调查。

1.2.2抗病性鉴定（1）苗期白粉病抗性鉴定：在培养箱内接种白粉病E09菌种，设置培养箱相对湿度为60%，光照强度为60%，光周期为光照14h、黑暗10h，对应温度为20℃和18℃。在苗盘内以感病对照辉县红种植感染行，待第一片叶充分展开时，将白粉菌孢子接种到供试材料上，接种10～15d后，当辉县红充分发病时，参照盛宝钦（1988）[7]提出的0～4六级反应型分级标准调查抗病性，其中，0型指免疫;0;型指有坏死反应，叶片有枯死斑;1型指高抗;2型指中抗;3型指中感;4型指高感。

（2）成株期白粉病鉴定：在大田进行成株期白粉病抗性鉴定，种植辉县红作为感染行，待辉县红充分发病后，采集病菌抖撒在供试材料叶片上，同时借助感染行诱发感染，按照0～4六级分级标准调查抗病性。

（3）成株期条锈病鉴定：参照NY/T1443.1—2007《小麦抗病虫性评价技术规范》第1部分《小麦抗条锈病评价技术规范》，在小麦拔节期进行人工注射接种条锈混合病菌（条中32和条中33），以辉县红作为感病对照并种植感染行。待辉县红充分发病后，按反应型0～4六级分级标准调查抗病性。

（4）成株期叶锈病鉴定：供试材料成株期叶锈病的鉴定参照《小麦抗病虫性评价技术规范》第2部分《小麦抗叶锈病评价技术规范》，以辉县红作为感病对照并种植感染行，待辉县红充分发病后，按反应型0～4六级分级标准调查抗病性。

1.2.3荧光原位杂交首先参照Dolezel等[8，9]的方法，稍作改动，获得根尖有丝分裂中期染色体制片;然后利用略微调整的寡核苷酸探针套[10]进行原位杂交，在同时进行寡核苷酸探针套FISH和GISH时，将pSc119.2-1的修饰改为TAMRA，以便与绿色基因组探针区别。并参考Zhuang等[11]描述的FISH程序，在杂交液中额外加入黑麦基因组DNA探针2.5μL和YN15基因组DNA1.7μL作为封阻。原位杂交时，在105℃加热1min，取出后迅速置于-20℃冰乙醇10min以上;期间将制片置于70%乙醇+NaOH中，24℃變性6min，迅速依次置于70%、95%、100%乙醇，各脱水3min，用吸耳球吹干;杂交液和片子均变性完成后，将杂交液滴到盖玻片的分裂相上，于37℃恒温箱杂交6h以上，复染并镜检。

2结果与分析

2.1农艺性状调查及抗病性鉴定

在六倍体小黑麦20090148与多个普通小麦材料复合杂交后代中，筛选到综合表现较好的四份材料：127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1，对其进行田间成株期农艺性状调查。四份材料平均株高最高的为134-5-1，最低的为127-12-2，株型均为中间型，且有芒，穗型分为长方穗、棍棒穗和圆锥穗三种类型，除134-5-1外均抗倒伏（图1和表1）。

间白粉病、田间条锈病及田间叶锈病均表现免疫、高抗或中抗，可以作为抗病材料选育的种质资源。

2.2细胞学鉴定结果

本研究利用改进的染色体原位杂交技术，通过一次细胞学实验，同时获得GISH与FISH两次实验的结果，不仅极大地优化了实验效率，而且可以明确所鉴定材料中外源黑麦染色体的具体同源群、核型以及普通小麦的染色体核型。

结果（图3）显示，四份小黑麦种质系材料的染色体数目均为2n=42条，其中127-12-2、134-5-1和125-3-1中未检测到较大片段外源染色体，推测为小麦-黑麦渐渗系材料;131-2-3虽然染色体为42条，但是出现2D染色体被2R染色体取代的现象，为2D/2R代换系。

在细胞学结果获得的基础上，构建了127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1的核型，见图4。对种质系131-2-3的小黑麦亲本20090148、普通小麦亲本SN224和济麦22也分别进行了原位杂交鉴定，构建染色体核型，并将三个亲本材料的染色体与131-2-3的染色体进行核型比对，结果（图5）显示，除2R代换了普通小麦的2D染色体外，131-2-3中的6A、1B和2B染色体与三个亲本染色体上的信号位点均出现了差异，表明131-2-3染色体结构发生了较大的变异。

3讨论与结论

小黑麦异染色体系的创制是黑麦中优异基因向普通小麦转移的主要途径，它的创制为优良种质材料的选育及进一步明确抗病来源及基因定位创造了条件。作为重要的白粉病抗源，小黑麦异染色体系已经被发掘出多个白粉病抗性基因。例如：最早在小麦-黑麦易位系品种Transec中发现的Pm7基因，来自黑麦Rosen;携带位于1RS上的Pm8基因的易位系被广泛种植;利用X射线处理得到的1AL/1RS易位系Amigo，含有位于1RS上的Pm17基因以及最早在6BS/6RL易位系MIP6中发现的Pm20基因[12]。

同时，对于黑麦条锈病抗性基因的挖掘也是从选育小黑麦异染色体系开始的。已正式命名的小麦条锈病抗性基因中，Yr9基因[13]源于德国黑麦Petkus，此外，2010年赵毓将小麦-奥地利黑麦双二倍体与阿勃6B缺体系杂交，筛选出了对白粉病和条锈病皆免疫的6R/6A代换系[14];2011年，张怀琼等选育了高抗条锈病的小麦-黑麦6B/6R易位系，确定条锈病抗性来自6R易位片段[15];2013年，雷孟平在小麦-非洲黑麦双二倍体与小麦杂交后代中筛选出免疫条锈病的6R/6D代换系[16]，综合以上材料选育的结果，可以说明6R染色体上可能携带新的条锈病抗性基因。

此外，叶锈病抗性基因Lr45是在一个日本小麦-黑麦T2AS-2RS·2RL易位系中被发现的，来自黑麦Petkus，位于2RS上，是我国小麦叶锈菌的有效抗性基因，尚未发现对Lr45基因有毒性的叶锈菌株，在小麦育种中具有很大的应用潜力。

通过染色体工程和基因工程等方法对小黑麦异染色体系进行改良选育优良材料并研究黑麦染色体抗性基因，对于拓宽小麦的基因资源，培育高产优质小麦品种起着至关重要的作用。本研究通过表型鉴定及细胞学检测的手段，获得了127-12-2、134-5-1、131-2-3和125-3-1四份优异小黑麦异染色体系材料，可用于进一步创制优良育种材料。

参考文献：

[1]李晴祺.冬小麦种质创新及评价利用[M].济南：山东科学技术出版社，1998.

[2]郝晨阳，王兰芬，张学勇，等.我国育成小麦品种的遗传多样性演变[J].中国科学C辑：生命科学，2005，35（5）：408-415.

[3]毛勇.小麦高抗条锈病新品系98-1054系列的分子细胞遗传学鉴定[D].雅安：四川农业大学，2012.

[4]贾举庆，郭红媛，李倩冉，等.抗条锈小麦-非洲黑麦渐渗系的分子细胞学鉴定[J].山西农业大学学报，2012，32（4）：301-306.

[5]李宇新，張利国，厉永鹏，等.小麦-黑麦二体代换系间杂交诱导染色体易位的研究[J].中国农学通报，2013，29（30）：41-44.

[6]李立会，李秀全，杨欣明.小麦种质资源描述规范和数据标准[S].北京：中国农业出版社，2006.

[7]盛宝钦.用反应型记载小麦苗期白粉病[J].植物保护，1988（1）：49.

[8]DolezelJ，CihalikovaJ，LucrettiS.AhighyieldprocedureforisolationofmetaphasechromosomesfromroottipsofViciafaba[J].Planta，1992，188：93-98.

[9]DolezelJ，CihalikovaJ，WeiserovaJ，etal.Cellcyclesynchronizationinplantrootmeristems[J].MethodsCellSci.，1999，21：95-107.

[10]DuP，ZhuangL，WangY，etal.DevelopmentofoligonucleotidesandmultiplexprobesforquickandaccurateidentificationofwheatandThinopyrumbessarabicumchromosomes[J].Genome，2017，60（2）：93-103.

[11]ZhuangLF，LiuP，LiuZQ，etal.Multiplestructuralaberrationsandphysicalmappingofryechromosome2Rintrogressedintowheat[J].Mol.Breed.，2015，35：133.

[12]孙媛媛，杜秉昊，汪慧，等.小麦改良的可利用资源：黑麦抗病基因[J].植物遗传资源学报，2014，15（2）：327-332.

[13]BasnetBR，SinghRP，IbrahimAMH，etal.CharacterizationofYr54andothergenesassociatedwithadultplantresistancetoyellowrustandleafrustincommonwheatQuaiu3[J].MolercularBreeding，2014，33（2）：385-399.

[14]赵毓，王长有，刘新伦，等.小麦-黑麦衍生系的细胞学和抗病性鉴定[J].西北农业学报，2010，19（6）：74-77.

[15]张怀琼，任正隆.黑麦抗条锈病基因对小麦高产品种绵阳11的直接转移[J].四川农业大学学报，2011，9（3）：193-196.

[16]雷孟平.小麦-非洲黑麦抗性新种质的分子细胞遗传学鉴定[D].成都：电子科技大学，2013.

推荐访问: 黑麦 创制 抗病 染色 鉴定