【第一作者简介】仕治达(1987-)，男，住院医师，硕士，主要从事计划生育研究工作。
△【通讯作者】王磊光
DOI:10.3969/j.issn.1672-1993.2014.07.027
【摘要】近年的研究热点显示Y染色体遗传缺陷因素所致的男性生精障碍是不育的重要病因之一。人类基因组的成功测序认为Y染色体的同源性重组是微缺失的分子基础。现研究主要在AZF基因。现研究发现在Y染色体上的220个基因中，无精子症或少精子症患者位于Y染色体的长臂(Yq11)无精子因子(AZF)区的16个编码基因有缺失，是已知的导致男性不育的最主要的分子遗传病因。临床上常使用提纯周围血白细胞DNA加Y染色体特异性引物进行PCR扩增检测，为明确Y染色体基因的功能以及相互之间的联系及基因治疗奠定基础。
【关键词】Y染色体缺失;男性不育;无精子因子
Research progress of Y chromosome microdeletion and male infertilitySHI Zhida, TAO Guozheng, SUN Lin, WANG Leiguang△, QIU Yi. Shandong Provincial Institute of Science and Technology for Family Planning (Key Laboratory for Birth Regulation and Control Technology of National Health and Family Planning Commission), Jinan 250002, China
【Abstract】Recent researches have showed that male spermatogenic failure caused by the genetic defect of Y chromosome is one of the major causes of male infertility. The successful sequencing of Y chromosome uncovers that homologous recombinant is the molecular base of its microdeletion. The current researches focus mainly on the AZF genes. According to such researches, 16 coding genes located at AZF in the Y chromosomal long arm (Yq11) of all the 220 genes of Y chromosome are missing for patients with azoospermatism and oligospermatism, which has been demonstrated to be a main genetic disorder causing male infertility. PCR amplification test is often used with WBC DNA and Y chromosome specific primers to define the function of Y chromosome genes and their mutual relationships, laying the foundation of spermatogenesis.
【Key words】Y chromosome microdeletion; Male infertility; Azoospermia factor
【中图分类号】R698+.2【文献标志码】A
根据最新WHO规定育龄夫妇经12个月以上不避孕性生活史而仍未受孕的即可定为不育症。统计学数据发现全世界约有10% ~15%的已婚夫妇不能正常生育,其中因男性因素所引起的不育约占不孕不育总数的20%\[1\],而另外大约有30%是由夫妇双方共同原因导致的。近年来男性不育患者的数量在全世界范围内呈现明显的上升趋势，而男性不育门诊中高达60%~75%的患者却只表现为精子质量或活性异常的无精子症和少精子症等。造成男性不育的原因可能是由于多种因素的影响，但是因遗传缺陷引起的男性精子生成发育障碍约占总不育因素的30%\[2\]，其中15%~20%的男性不育患者却表现为无精子症、大约10%左右的患者仅表现为少精子症。Y染色体是男性与女性相区别的遗传基因，作为男性特有的基因与特异的Y染色体遗传性有着密切关系。近十年的研究发现导致男性不育的遗传因素主要是Y染色体微缺失。其长臂上含有的无精子因子（azoospermia factor，AZF）是导致睾丸精子生成障碍的主要原因，这同时说明AZF微缺失是引起男性不育的一个重要因素。2003年人类基因组测序的完成以及现代分子生物学、分子遗传学和辅助生殖技术的发展，为Y染色体的基因结构和分子功能，以及Y染色体AZF微缺失与男性不育的进一步研究提供了拓展的思路和方向。本文通过综述Y染色体的基本结构、微缺失，进一步了解与男性不育方面的研究进展。
1Y染色体
Y染色体以着丝粒为分界分为长臂(Yq)和短臂(Yp)，是人类男性有别于女性的染色体近端着丝粒基因。细胞遗传学家根据Y染色体不同的功能将其分为：假常染色体，常染色体，异染色体。1959年Jacobs和Ford的研究虽然证实Y染色体上存在决定性别的基因，但是大多数科学家却还是认为Y染色体是一条没有重要功能的染色体。1976年Tiepolo等\[3\]通过研究不育生精障碍患者证实Y染色体长臂(Yq11)有缺失,从而科学推断Yp存在着与睾丸生精障碍有关的基因片段：无精子症因子。上世纪90年代科学家在Y染色体上发现睾丸决定基因(sex determining region Y,SRY)，以后有关无精子症因子对睾丸生精分化过程的基因研究再次引起世界的关注。之后几十年的科学研究探索发现精子的分化调控基因AZF位于Y染色体Yq11，它的微缺失与男性生精功能发生障碍和异常具有相关性。1996年Vogt等\[4\]把主导精子形成发生的Yq11基因片段按功能分为AZFa、AZFb、AZFc区。之后Kent-First等\[5\]发现AZFd作为一个单独的基因结构存在于AZFb和AZFc之间。
2003年伴随着人类基因组测序的成功完成,同时也慢慢揭开了Y染色体基本结构和功能的神秘面纱\[6\]。Y染色体是大小约含59Mb基因片段的DNA,其中Y11的异染色体区(Yq12)占有所有片段的60%。大约5%的Y染色体基因片段是位于Y染色体两端的假常染色体区,其余的95%为Y染色体特异部分（MSY）,它是位于常染色质区和异染色质区结合处的相互嵌合体\[6\]。前辈们多年的Y染色体研究探索，同源序列更加丰富的男性特有基因Y染色体在基因重组时导致错乱排序的比率相对增加，从而造成不育患者的DNA分析为相关基因重复增加或缺失，Meta分析发现人类性染色体以基因缺失更为常见。AZF微缺失作为Y染色体缺失中最常见的类型，与男性不育及精子生成障碍存在因果关系。故Y染色体微缺失在睾丸生精障碍过程中认为是AZF微缺失。
2AZFa区
AZFa基因片段长约800kb，于Yq11区域,主要包括UPS9Y（ubiquitin-specific protease 9，Y chromosome）和DBY（DEAD box on the Y）两个基因片段，由单链DNA复制构成。AZFa最早发现的候选基因UPS9Y，虽然只占AZFa一半一下的区域，仅仅只有46个外显子，但是研究证实AZFa的大部分缺失均同时伴有此基因的部分或者全部丢失。临床研究证实USP9Y缺失的病例均为原发性无精子症。并且Sun等\[7\]于1999年通过实验对照不育患者与正常男性的USP9Y序列分析，证明该序列的缺失是影响男性不育的一个重要因素，并且对精子生成障碍有着重要作用。DBY基因片段长度大小约16kb，含有更少的17个外显子基因组。该基因位于USP9Y下游约43 kb处，可能编码一种ATP依赖解旋酶，它具有RNA解旋酶活性并且与DEAD-box相关。科学研究发现DBY基因的缺失的主要临床表现为男性不育中的严重少精子症、唯支持细胞综合征(Sertoli cell-only syndrome,SCOS)。但是随着之后的研究发现单纯AZFa缺失现实比较罕见，仅占男性不育Y染色体微缺失中的5%左右。Meta分析显示Ⅰ型SCOS只是AZFa缺失的部分临床表现，同时多伴有严重少精子症、睾丸体积缩小等其他显著临床缺失现象\[4\]。
3AZFb区
AZFb基因片段大小约32Mb,位于Yq1123区域，主要的缺失基因为 RBMY1（RNAbinding motif Y-chromosome 1），造成男性不育的主要原因是引起减数分裂异常。RBMY含有功能片段的外显子12个，编码蛋白：靠近C端的功能片段为SRGY盒（serine-arginine-glycine-tyrosine box）；在N端含有的结构域具有RNA结合功能。科学研究证实敲除小鼠RBMY基因会造成生殖细胞生精阻滞现象\[8\]。此外，热休克因子 Y（ heated shock factoryY，HSFY）也是 AZFb的候选基因，它的缺失与精子生成关联。RBMY1在 AZFb的 D16亚区，有睾丸特异表达。AZFb区的缺失包括 AZFb和 AZFb+c缺失。Yogev等\[9\]研究发现基因重组过程中的缺失延伸和 X、Y染色体配对的缺失功能基因是AZFb/AZFb+c缺失患者引起生精障碍的主要原因。精子生成障碍使减数分裂停留在初级精母细胞阶段的原因是染色体基因重组时的不配对。
4AZFc区
AZFc区缺失是AZF微缺失类型中最为常见类型，占男性不育因素Y染色体微缺失的60%左右。最近几年AZFc区研究的热点主要方向是“AZFc区部分缺失”，临床主要表现为不同程度的生精障碍：无精子症、少精子症。AZFc基因片段长度约35Mb，近异染色质区。目前已知的AZFc区主要的候选基因有四个：CDY、DAZ、PRY2、BPY，均为多拷贝基因。
41DAZ基因
DAZ结构基因（deleted-in-azoospermia）是当前科学家研究最多的AZFc区的缺失基因。它通过精子细胞中基因特异表达DNA，调控mRNA编码 RNA结合蛋白，从而影响男性的生精功能。Slee等\[10\]在1999年通过转基因技术在人类和小鼠的DAZ基因中研究，证实DAZ具有生精能力。2000年Saxena等\[11\]证实有DAZ1/2/3/4四个基因片段复制在 AZFc区内，其中DAZ1基因片段含有有两个RRMs、DAZ2和DAZ3却只含有一个RNA结构域(RNA recognitionmotif,RRM)识别基因、DAZ4基因片段含有最多的3个RRMs。一般男性只有1个DAZ结构基因，但是部分男性却有2~6个DAZ基因。目前为止已发现的DAZ基因缺失包括3种类型：DAZ1/DAZ2、DAZ3/DAZ4和全部缺失\[12\]。虽然现在DAZ基因相关的研究已经多年,但其是否是导致男性不育的生精障碍的导致原因之一目前尚无定论。部分科学家研究表明,DAZ全部缺失或部分缺失均是导致男性不育的原因\[13\],并且证实DAZ基因复制的过程中引起的基因缺失可垂直传递传递给下一代。DAZ基因缺失患者与AZFa区缺失引起的唯支持细胞综合征有很多相同的临床表现表型,比如无精子症或少精子症等相似临床表型。然而另外一些专家却认为DAZ基因缺失的临床表现和缺失类型存在争议，与男性精子生成没有相关性。Fernandes等\[14\]研究认为DAZ的基因复制在精子生成过程中起作用的部分只是其中的部分片段，未缺失的 DAZ基因拷贝功能作用决定生精功能是否正常。最近 Collier等\[15\]研究DAZ基因，认为其表达的结构蛋白可以与聚合 A结合蛋白（polyA-binding proteins, PABPs）结合，通过影响mRNA的翻译来控制精子发生和成熟。
42CDY基因
CDY基因（chromosome domain Y）作为人类男性特有的基因片段，位于非编码区，主要通过修饰DNA复制和翻译表达的的蛋白（1个催化结构域、1个结合结构域）来影响精子的发生。据最新研究发现人类CDY基因与小鼠的 CDY1可能起源于同一基因复制。实验小鼠敲出DAZ基因后可引起CDY1的一个基因复制缺失，但是单纯的CDY1缺失对生精过程的影响尚需进一步的研究证实。Kleiman等\[16\]通过实验对照小鼠 CDY1与人类CDY基因的表达，认为小鼠CDY1的基因缺失可引起小鼠睾丸生精障碍，而人类CDY的基因缺失没有显著引起生精障碍。Noordam等\[17\]通过定量 PCR方法检测人类男性性染色体基因表达过程中的实际复制情况，证明 AZFc区基因片段的加工修饰贯穿于整个演变过程中，并通过一种剂量效应来维持 TMC（total motile sperm count）的正常进而保证男性的生殖能力。
43AZFc区部分缺失
AZFc区先研究发现含有 12个基因片段，其基因片段部分或全部缺失均可导致精子生精功能障碍。AZFc区部分缺失包括: gr/gr缺失16Mb、b1 /b3缺失16Mb、b2 /b3缺失18Mb，此外，AZFc区全部缺失称为 b2/b4缺失。AZFc区部分缺失研究发现 gr/gr缺失发生率最高，b1/b3缺失率最低，而b2/b3缺失率位于两者之间。国外学者通过Meta分析gr/gr缺失的18篇论著认为,gr/gr缺失与男性不育显著相关(P<001)\[18\]。但是国内Zhang等\[19\]研究分析我国男性gr/gr缺失情况，生精障碍患者中gr/gr缺失率仅为103%，而正常男性gr/gr缺失率也高达8%,所以gr/gr缺失与生精障碍无关。并且国内Wu等\[20\]研究也得到了相同的结果。因此现在普遍认为gr/gr缺失可能存在地域差异性，西方人较东亚人低。gr/gr缺失与无精子症之间的关系随着地域和种族而改变。
b2/b3缺失也称g1/g3缺失，缺失的基因片段长度为18Mb。现普遍认为其缺失与睾丸生精障碍无关。 Fernandes \[21\]、Ferlin等\[22\]报道b2/b3缺失既存在于患者中也存在于健康对照人群中，其与生精障碍之间没有关联性。而在对中国人群的研究中，Wu等\[20\]、马明义等\[23\]认为 b2/b3缺失与我国男性生精障碍有关，可能是生精障碍的一个危险因素。因此b2/b3缺失与生精障碍之间的关联性同样存在群体地域差异。AZFc全缺失又称为 b2/b4缺失，主要包括DAZ、CDY1、BPY2缺失。AZFc全缺失也是因为睾丸精子发育不良而造成不育。Tyler-Smith C等\[24\]研究认为b2/b4缺失也可遗传给下一代引起不育。蔡志明等\[25\]对AZFc区微缺失与男性不育的16篇有关文献资料进行Meta分析，认为AZFc区微缺失与男性不育有相关性(95% CI:2 01~3 14)。戴汝琳等\[26\]研究发现AZFc区部分缺失导致男性不育存在明显地域性差异，在中国东北地区AZFc区的b2/b3缺失与男性少精、弱精有关，而gr/gr缺失却没有统计学意义，可能单纯的gr/gr缺失只是引起男性少精、弱精的风险因子。
5AZFd区
Kent-First等\[5\]用序列标签位点发现了AZF的新区域AZFd，位于AZFb和 AZFc之间。虽然AZFa、AZFb和 AZFc区部分候选基因均与男性不育有关，可是至今没有发现 AZFd区候选基因直接引起男性精子减少或质量降低。Muslumanoglu等\[27\]定位研究分析AZFd区DYS237结构基因，认为AZFd是影响生精的风险因子。AZFd微缺失的患者临床表现为轻度少精症或精子形态异常。
6展望
Y染色体微缺失是造成男性不育的重要原因。尽管现在对AZF微缺失的研究已经进入到 Y染色体缺失类型及单倍型等分子水平\[22\]，但对AZFc区部分缺失的研究却相对比较少，其与男性不育还有很多的争论尚待证实。现普遍共识为 AZF区微缺失对精子生成存在着地域及人种的差异，我国对AZFc区部分微缺失与男性少精、弱精的研究需更多地区的研究人员参与。相信随着国内对Y染色体部分缺失区域性研究的不断深入，为我国男性不育患者的基因诊断及临床治疗提供更理想的理论和科学基础依据。
参考文献
\[1\]de Kretser DM. Male infertility. Lancet, 1997, 349(9054):787-790.
\[2\]Martin RH. Cytogenetic determinants ofmale fertility. Hum Reprod Update, 2008, 14(4): 379-390.
\[3\]Tiepolo L, Zuffardi O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm. Hum Genet, 1976, 34(2): 119-124.
\[4\]Vogt PH, Edelmann A, Kirsch S, et al. Human Y chromosome azoospermiafactors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum Mol Genet, 1996,5(7): 933-943.
\[5\]Kent-FirstM, Muallem A, Shultz J, et al. Defining regions of the Y-chromosome responsible female infertility and identification of a fourth AZF region (AZFd) by Y-chromosome microdeletion detection. Mol Rep rod Dev, 1999, 53(1): 27-41.
\[6\]SkaletskyH, Kuroda-Kawaguchi T, Minx PJ,et al. The malespecific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Nature, 2003, 423(6942): 825-837.
\[7\]Sun C, Skaletsky H, Birren B, et al. An azoospermic man with a denovopoint mutation in the Y-chromosomal gene USP9Y. Nat Genet, 1999, 23(4):429-432.
\[8\]Mahadevaiah SK, Odorisio T, Elliott DJ, et al. Mouse homologues of the human AZF candidate gene RBM are expressed in spermatogonia and spermatids, and map to a Y chromosome deletion interval associated with a high incidence of sperm abnormalities. Hum Mol Genet, 1998,7(4): 715-727.
\[9\]Yogev L, Segal S, Zeharia E, et al. Sex chromosome alignment atmeiosis of azoospermic men with azoospermia factor microdeletion. J Androl, 2004,25(1): 110-116.
\[10\]Slee R, Grimes B, Speed RM, et al. A human DAZ transgene confers partial rescue of the mouse Dazl null phenotype. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96(14): 8040-8045.
\[11\]Saxena R, de Vries JW, Repping S, et al. Four DAZ genes in two clusters found in the AZFc region of the human Y chromosome. Genomics, 2000,67(3): 256-267.
\[12\]阿周存,杨元,张思仲,等.严重寡精症 ICSI精子供体的 DAZ基因拷贝缺失研究遗传, 2006, 28(9): 1057-1060.
\[13\]Lin YW, Hsu LC, Kuo PL, et al. Partial duplication at AZFc YH, Hsiao on the Y chromosome is a risk factor for impaired spermatogenesis in Han Chinese in Taiwan. Hum Mutat, 2007, 28(5): 486-494.
\[14\]Fernandes S, Huellen K, Goncalves J, et a1. High frequency of DAZ1/DAZ2 gene deletions in patients with severo oligozoospermia. Mol Hum Reprod, 2002, 8(3): 286-298.
\[15\]Collier B, Gorgoni B, Loveridge C, et al. The DAZ family proteins are PABP-binding proteins that regulate translation in germ cell. EMBO J, 2005,24(14): 2656-2666.
\[16\]Kleiman SE, Lagziel A, Yogev L, et al. Expression of CDY1 may identify complete spermalogenesis. Fertil Steril, 2001, 75(1):166-173.
\[17\]Noordam MJ, Westerveld GH, Hovingh SE. Gene copy number reduction in the azoospermia factor c (AZFc) region and its effect on total motile spermcount. Hum Mol Genet, 2011, 20(12): 2457-2463.
\[18\]T-ttelmann F, Rajpert-DeMeyts E,et al. Gene polymorphismsandmale infertility-ameta-analysis and literature review. Reprod Biomed Online. 2007, 15(6): 643-658.
\[19\]Zhang F, Li Z, Wen B,et al. A frequentpartial AZFc deletion does not renderan increased risk of spermatogenic impairment in East Asians. Ann Hum Genet, 2006, 70(Pt3): 304-313.
\[20\]Wu B, LuNX, XiaYK,et al. A frequentY chromosome b2 /b3 subdeletion shows strong associationwithmale infertility inHanChinese population. Hum Reprod, 2007, 22(4): 1107-1113.
\[21\]Fernandes S, Paracchini S, Meyer LH, et al. A large AZFc deletion removes DAZ3/DAZ4 and nearby genes from men in Y haplogroup N. Am J Hum Genet, 2004, 74(1): 180-187.
\[22\]Ferlin A, Tessari A, Ganz F, et al. Association of partial AZFc region deletions with spermatogenic impairment and male infertility. J Med Genet, 2005, 42(3):209-213.
\[23\]马明义,钟一梅,韦小妮,等. AZFc区部分缺失与原发性男性生精障碍的相关性研究.华西医学, 2007, 22(2): 294-295.
\[24\]Tyler-Smith C, McVean G. The comings and goings of a Y polymorphism.Nat Genet, 2003, 35(3): 201-202.
\[25\]蔡志明. Y染色体及其微缺失与男性不育：过去、现在与将来.中华男科学杂志, 2010, 16(5): 387-394.
\[26\]Zhang YS, Ru-Lin Dai, et al. Analysis of Y chromosome microdeletion in 1738 infertile men from northeastern china .J Urology, 2013, 82(3):584-588.
\[27\]Müslümanoglu MH, Turgut M, Cilingir O, et al. Role of the AZFd locus in spermatogenesis. Fertil Steril, 2005, 84(2): 519-522.