综述液体和固体发酵法生产虫草素的研究状况，并展望其发展趋势。
蛹虫草; 虫草素; 发酵
虫草素在自然界中被发现仅存在于虫草属(Cordyceps)真菌中，其中蛹虫草（Cordyceps militaris）中含量较高，是目前生产虫草素的主要菌种。蛹虫草（C. militaris）是中国传统药用真菌中的一种，属子囊菌门（Ascomycota），肉座菌目（Hypocreales），虫草菌科（Cordycipitaceae），虫草属（Cordyceps［1］。现代医药学研究证明，蛹虫草中含有虫草素、虫草酸和虫草多糖等多种有效成分，用于肺结核、老人虚弱和贫血等疾病的治疗。虫草素对DNA和RNA合成，hnRNA和mRNA转录后修饰以及腺苷酸环化酶等均具有抑制作用，具有抗炎、抗真菌、抗癌及抗病毒等多种生理活性［2］。虫草素在美国已进入临床实验研究，用于白血病的治疗。
近几年随着对虫草素的深入研究，人们对虫草素的需求也逐渐增多，虫草素的来源有人工合成或天然来源提取2个途径。人工合成过程复杂且产量极低，且会产生毒副产品［3］，目前虫草素主要来源于天然材料的提取。虫草素的大量制备，将为虫草素的药理活性、临床药理学研究以及化学修饰等奠定基础，笔者对近年来发酵法生产虫草素的研究进行综述。
1 液体发酵法
国内外虫草素主要通过液体发酵制备，蛹虫草液体发酵的菌丝体和培养基中都含有虫草素，其中液体培养基中的虫草素含量高于菌丝体中的含量，国内外学者主要从培养基质、培养条件和菌种等方面加以优化，从而使菌丝体或培养基中虫草素含量提高。
1.1培养基的优化
1.1.1碳源
MAO等比较了乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、木糖作为碳源对虫草素产生的影响，发现葡萄糖为碳源时虫草素产量最高，达到262.7 mg/L；半乳糖作为碳源时，菌丝体长势最好；葡萄糖的浓度为40 g/L时虫草素的产量最高，超过55 g/L时对虫草素的合成反而不利 ［4］。FANG 研究发现高渗透压的培养条件不影响菌丝生长，但可能影响次级代谢产物的合成，不利于虫草素合成［5］。MASUDA等对葡萄糖与虫草素的关系进行研究发现，随着发酵液中的葡萄糖含量下降，虫草素的量开始增加，葡糖糖全部消耗完时，菌丝体出现自溶，但虫草素的含量仍有所提高［6］。
1.1.2氮源
MAO等同时还比较了水解酪蛋白、酵母提取物、蛋白胨、尿素及多种无机氮源对虫草素产生的影响，发现蛋白胨是最利于虫草素合成的氮源［4］，与蛋白胨可在胞内被蛋白酶分解成各种氨基酸被菌丝体利用有一定关系。不同的氨基酸在细胞生长和次生代谢物合成中起不同作用，研究表明酵母提取物和蛋白胨的混合物也是虫草素生产的较好氮源，酵母提取物和蛋白胨的比例为3∶1，虫草素产量可以达到最大；不同碳氮比对虫草素的产量也有影响，当氮源总量为10 g/L时，葡萄糖的量达到20 g/L，虫草素产量最高，并且当碳氮比保持不变，提高碳氮源的总量仍然可以提高虫草素的量［6］。
1.2培养条件
1.2.1pH值
培养基的pH值影响真菌的生长代谢，HSIEH等研究发现酸性条件下更适合次级代谢产物的合成［7］；对不同pH值的培养液中虫草素含量进行测定发现，pH值为4时，虫草素的产量最高［8］。
1.2.2培养液高度
MASUDA等比较了不同培养液高度对虫草素分泌的影响，发现培养液高度为1.8 ～5.3 cm时，随培养液高度的降低，虫草素含量提高［6］。
1.2.3培养方式
供氧在细胞生长和次生代谢产物合成中起重要作用，SHIH等发现最适合虫草素分泌的培养方式是振荡培养8 d和静置培养16 d相结合，该方式下虫草素含量比单纯振荡培养或静置培养要高［8］。
1.2.4转速
摇床转速影响深层液体培养时发酵液中的溶氧量，因此也会影响真菌的生长和代谢产物的形成。为考察适合蛹虫草生产虫草素的摇床转速，杜连祥等比较了100、125、150、175、200 r/min等不同转速对虫草素产量的影响，发现适于虫草素分泌的最佳摇床转速为150 r/min［9］。
1.2.5培养温度
温度影响细胞的酶活和发酵液的溶氧量，很多虫生真菌的最适生长温度都在20～30 ℃之间，对发酵培养的不同温度进行比较发现，适于蛹虫草菌丝体生长的最佳温度为 22 ℃，而产生虫草素的最佳温度为25 ℃［10］。
1.3外源添加物
1.3.1嘌呤类似物
MASUDA等在向培养基中添加腺苷后，虫草素的产量较未添加增加了15%，含量达到8.6 g/L ［10］。MASUDA等添加腺嘌呤后也有明显促进虫草素产生的作用，原因可能与腺苷和腺嘌呤为虫草素合成的前体有关［11］。研究表明添加甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸比添加酪蛋白氨基酸有更好的提高虫草素产量的作用，其中添加甘氨酸的作用最为明显，和对照相比提高了2.8倍；证明这3个氨基酸不仅仅是作为氮源,而且作为嘌呤相关的氨基酸促进虫草素产生。荆留萍发现核糖可以显著提高虫草素的产量［12］。另外2 mg/L的萘乙酸及5 mg/L的ADP对虫草素产量有较好的提升作用，发酵液中虫草素含量提高了30%左右［13］。
1.3.2金属离子
高浓度的金属离子对细胞有毒害作用，但合适的浓度有利于细胞的生长和次级代谢产物的合成。GU YX研究发现Mn2+可以帮助细胞克服氧胁迫，0.1 mmol/L的Mn2+可以提高虫草素的产量［13］。毛先兵等考察了盐磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和硫酸锰对虫草素合成的影响，发现硫酸亚铁和氯化钙对虫草素形成有显著的影响，其硫酸亚铁和氯化钙的有效浓度分别0.74、0.94 g/L ［14］。
1.3.3铵离子
MAO XB等发现在培养基中添加铵离子，当浓度为40 mmol/L 时虫草素含量最大，当浓度超过160 mmol/L后虫草素的含量明显下降。作者认为适当浓度的铵离子产生胁迫可以刺激北虫草的次生代谢途径［15］。
薛俊杰，等：发酵法生产虫草素研究进展
1.3.4邻苯二甲酸二丁酯
李祝在两个不同品种蛹虫草摇瓶培养到24 h和120 h时加入浓度为6%的邻苯二甲酸二丁酯，继续培养到196 h，收集菌丝体，虫草素总产量分别比未添加有机相的对照组提高了7.48倍和7.09倍［16］。
1.3.5多糖激发子
李祝等还考察了真菌多糖激发子对提高虫草素含量的影响，他们从疫霉（Phytophthora）和曲霉（Aspergillus）两株真菌菌丝体中分别提取其多糖作为激发子，在蛹虫草的不同生长阶段加入，结果当疫霉多糖单独加入时，可增加虫草素含量；单独加入曲霉多糖，可增加菌丝体生物量。当发酵开始时加入60 μg/mL疫霉多糖，当发酵到72 h，再加入80 μg/mL曲霉多糖，继续发酵120 h，虫草素的含量可达到21.98 mg/g,为对照的5.7倍，菌丝体生物量为对照的1.49倍，但没有报道对胞外液中虫草素含量的影响［17］。
1.4菌种的影响
研究发现虫草素的分泌与菌株特性有很大关系,并不与菌株的长势直接相关(生物量高的菌株,虫草素产量不一定高)［18］。DAS等使用高能量粒子束得到了一个虫草素的高产菌株G81-3，该菌株在合适的培养基中虫草素的产量比传统野生型产量提高72%，达到8.6 g/L［19］。这是目前报道的产量最高的菌种。
2 固体发酵法
固体培养不但具有设备投资少、技术要求较低等优点，而且培养物的虫草素含量高于液体发酵，大量研究探索在不同培养条件、配方和菌种等方面对虫草素产量的影响。
2.1发酵配方
培养基配方对虫草素的产量影响较大，文庭池对影响固体发酵的各试验因子进行优化，当配方为:酵母膏22.6 g/L、蛋白胨6.0 g/L、葡萄糖25.4 g/L、pH 6.6、水料比1∶1时,虫草素含量可达到最高0.42%［20］。温鲁比较了豆粉、蛹粉、豆粨和鱼粉等氮源对虫草素产量的影响，结果表明：用豆粉作为氮源时虫草素含量最高［21］。王春华发现蛋白胨和麸皮作为氮源时子实体中虫草素的含量最大，麸皮含有丰富的微量元素以及维生素等，还具有价格便宜、容易获得的优点，是优良的培养原料［22］。韦会平通过正交试验，确定固体培养生产虫草素的最佳培养基配方为:水料比1:1、营养水中酵母膏22.6 mL/L、蛋白胨6.0 g/L、葡萄糖25.4 g/L、 KH2P04 2 g/L、 MgS04 0.5 mg/L，pH 6.6［23］。
2.2基质大小
文庭池发现大米作为培养基质时，较小的米粒有利于虫草素的积累，较大的米粒有利于虫草菌丝体的生长。随着米粒的增大,米粒间孔隙率越大,透气性越佳,菌丝生长越好,就偏向生物量方面积累。相反随着米粒的减小,用于生长的表面积就越大,米粒间孔隙率就越小,培养基质容易粘在一起,透气性变差,蛹虫草菌丝生长受阻,就偏向次生代谢产物积累方面;当米粒大小为40目时，虫草素产量达到最大［20］。
2.3培养条件
韦会平观察到当菌丝长满培养基后,如果给予充足的光照,虫草素的含量就高;如果光照不充足,培养基中虫草素含量始终维持在极低的水平。他通过正交试验确定固体发酵生产虫草素的最佳条件为：每天光照18 h、光照强度4400 lux、温度22 ℃，经过大约13 d的培养，培养基中虫草素的含量达到6 mg/g以上［24］，作者推测培养基中虫草素的产生可能和菌丝体内的光反应机制相关，液体发酵法往往使得菌丝体得不到良好的光照，固体发酵法相反。王菊凤发现自然光表现出对虫草素形成有一定的抑制作用，具体作用机制尚不明确［25］。韦会平研究表明：虫草固体发酵最适温度为18～22 ℃，当温度从17 ℃上升至25 ℃时,虫草素含量增加了近4倍。显然，一定范围内，高温有利于虫草素的产生。他还发现现蕾期为收获提取虫草素的最佳生长时期［24］。
2.4外源添加物
周毅峰研究表明加硒培养的蛹虫草中虫草素、腺苷、虫草多糖、甘露醇、氨基酸、矿物元素 6种功效成分含量均高于普通蛹虫草［26］。
2.5菌种优化
周洪英以虫草素含量和子实体性状为筛选指标,经过初步的遗传稳定性测试,得到虫草素含量显著提高的5个稳定原生体融合子；且融合子菌丝中虫草素含量普遍提高［27］。李文选择合适剂量的低能离子束注入蛹虫草选育出虫草素含量较高的 15 个菌株，最高含量达11.9 mg/g，比原始菌株增长了近 30%［28］。杜爱玲将采集自陕西的野生蛹虫草菌株通过子座组织分离法选育出高虫草素含量蛹虫草新菌株“海州1号”，该菌株虫草素含量达到 24.98 mg/g［29］。
3 展望
近年来，虫草素药用活性研究越来越广泛，制备大量便宜的虫草素成为制约虫草素研究和开发的瓶颈。固体培养由于成本低、设备简单，在国内已经广泛开展研究，可以成为制备虫草素的重要来源；优化培养基成分、培养时间、温度等因素是未来研究虫草素液体发酵生产的重点之一；通过基因改造来提高虫草素的产量将是未来的研究热点。
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Cordycepin Production Using Fermentation
Methods-Present Status and Future Prospects
XUE Junjie1,2，ZHANG Jingsong1，LIU Yanfang1，ZHAO Mingwen2，TANG Qingjiu1*
1National Engineering Research Center of Edible Fungi； Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics
and Breeding； Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China;
2Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095，China
Current research relating to cordycepin production using submerged and solid state fermentation methods have been reviewed，and future developmental trends are discussed.
Cordyceps militaris; cordycepin; submerged and solid state fermentation methods