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摘 要：初步筛选了地胆粉的最佳用酶及通过了MTT法测定酶解产物的抗肿瘤活性。模拟体外胃肠道消化系统以胃蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4种蛋白酶进行酶解反应，采用MTT法检测酶解产物对肝癌细胞BEL-7402、乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果。结果弹性蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶的水解度分别为2.84%、13.11%、10.31%，其中胰蛋白酶的酶解液对肝癌细胞BEL-7402的抑制率明显高于对照组，且成剂量依赖性，其他酶解液的抑制作用不显著。胰蛋白酶的酶解液对乳腺癌细胞MCF-7也有一定的抑制作用，其他酶解液无效果。胰蛋白酶是地胆粉抑制肝癌细胞的最佳酶，酶解度与抑制肿瘤细胞生长没有直接关系。
关 键 词：地胆粉;酶解法;最佳用酶;MTT实验;抗肿瘤活性
中图分类号：TQ 464 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2019）07-1445-04
Abstract： To screen the optimal enzyme of Didan powder and determine the anti-tumor activity of the product by MTT assay， four kinds of proteases including pepsin， elastase， trypsin and chymotrypsin were used to simulate the enzymatic hydrolysis reaction of the gastrointestinal digestive system in vitro. The inhibitory effect of the products of enzymatic hydrolysis on liver cancer cells bel-7402 and breast cancer cells McF-7 was detected by MTT assay. The degrees of hydrolysis of elastase， pepsin and chymotrypsin were 2.84%， 13.11% and 10.31%， respectively. The inhibitory rate of trypsin hydrolysate on liver cancer cell bel-7402 was significantly higher than that of the control group， and the inhibitory effect of other hydrolysates was dose-dependent. The enzymatic hydrolysate of trypsin also had certain inhibitory effect on McF-7 of breast cancer cells， while other enzymatic hydrolysates had no effect. Trypsin was the best enzyme to inhibit hepatocellular carcinoma cells， and the degree of enzymatic hydrolysis was not directly related to the inhibition of tumor cell growth.
Key words： Didan powder; enzymatic hydrolysis; optimum enzyme use; MTT method; enzymatic hydrolysis degree
地胆，又名蚖青、地龙、青虹，为芫菁科圆胸地胆芫菁Meloe corvinus Marseul的干燥全虫。味辛，性温，有毒，归肝、肺經[1]。《本草纲目》中记载“地胆，状如斑蝥。色虽各异，功亦相近”，临床应用历史悠久，主治鼻中息肉肿大、气息鼻塞不通、瘰疬成疮有脓、小肠气痛等，具有破血逐瘀、散结消癥、攻毒蚀疮的作用[2]。现代研究表明，地胆有良好的抗癌作用，临床用于肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、白细胞减少、慢性肝炎等疾病的治疗[3]，这类动物中药具有广阔的应用前景。本实验探索地胆粉的酶解条件，模拟人体的消化环境，以胃蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等酶解，测定地胆粉中蛋白质的酶解度，通过肝癌细胞BEL-7402和乳腺癌细胞MCF-7对酶解产物的抗肿瘤活性进行研究，初步筛选地胆粉的最佳用酶，进一步为地胆粉现代药理研究和临床应用提供实验依据[4]。
1 实验部分
1.1 试剂
胃蛋白酶和胰蛋白酶（中国医药集团化学试剂有限公司）;弹性蛋白酶和糜蛋白酶（上海野生动物科技有限公司）[5];MTT（武汉盖云天生物科技有限公司）;胰酶（上海碧云天生物技术有限公司）;注射用顺铂（齐鲁制药有限公司）;改良的RPMI-1640培养基和胎牛血清（Simer-Fiisher生物制品北京有限公司）;乳腺癌细胞和肝癌细胞系（山东省立医院提供）;其余试剂均为分析纯.
1.2 仪器
UV9100B 型紫外-可见分光光度计（北京雷波泰克仪器有限公司）;酸度计（上海仪电仪器有限公司）;MultiskanMk3 型酶标仪（上海赛默福仪器有限公司）;半微量凯氏定氮仪（天长市旭力玻璃有限公司）等。
1.3 药品
地胆，购自河北安国药材市场，经山东中医药大学高德民教授认定为真品。
2 方法
2.1 地胆酶解液的制备
准确称取1.000 0 g干燥地胆冻干粉5份，加40 mL蒸馏水调至比例为1：40，置于250 mL锥形瓶中，30 ℃水浴超声处理30 min取出。按表1方法处理，获得五种地胆酶解粗液，分别在3 000 r/min条件下高速离心10 min，抽滤，定容至100 mL，得到地胆粉酶解液，将每种地胆粉酶解液分成两部分，一部分用于测定蛋白质酶解度，另一部分冷冻干燥进行抗肿瘤研究[6]。
2.2 茚三酮溶液的配制
精确称取茚三酮0.500 0 g、果糖0.300 0 g、磷酸氢二钠10.000 0 g、磷酸二氢钠6.000 0 g于烧杯中，加蒸馏水适量，将溶液超声处理定容至100 mL并配制成茚三酮显色剂。
2.3 氨基肽氮含量的测定
将甘氨酸干燥至恒重，称取0.100 0 g加水溶解定容至100 mL，移取2 mL稀释浓度为2 µg·mL-1，再配成浓度2、4、6、8、10 µg·mL-1的标准甘氨酸溶液。分别取2 mL甘氨酸稀释液于试管中，加入1.00 mL茚三酮显色剂，振荡，晃匀，置于100 ℃水浴锅中加热15 min，同时进行空白试验，冷却20 min，加入40 %乙醇溶液混匀[7]，静置15 min，在紫外分光光度计570 nm下测吸光度，获得标准曲线。根据上述方法，对样品中氨基酸含量进行三次平行测定，计算总氮含量。
2.4 蛋白质水解度的测定
采用半微量凯氏定氮法量化地胆粉蛋白质酶解度，公式如（1）。经测定，0.08 g地胆冻干粉总氮量为26.435 mg·g-1。将水解液中的游离总氮含量和半微量凯氏定氮中地胆冻干粉的总氮量带入公式，计算酶解度：
酶解度（DH）%=（b-c）/（a-c）×100% （1）
式中： a —原料中的总氮数;
b —地胆酶解液中的氨基氮数;
c —原料中游离的氨基氮数。
2.5 药理实验
2.5.1 配制供试品溶液
精确称取地胆冻干粉20 mg，溶于10 mL无血清培养液，配成浓度为2 mg·mL-1地胆酶解液，用0.22 µm滤头过滤，将配好的2 mg·mL-1地胆酶解液二倍稀释，配成5个不同浓度梯度的供试品溶液。
2.5.2 细胞复苏及培养
将冻存的肝癌细胞和乳腺癌细胞解冻，在100 0 r·min-1条件下离心3 min并加含10%血清的培养基于CO2培养箱中培养。
2.5.3 细胞接种
待细胞充满，形态圆润、无悬浮细胞时，取胰酶细胞消化液0.5 mL进行消化，消化均匀后，转移至96孔板中培养。
2.5.4 加药
待96孔板中的细胞长满、均匀、形态圆润后，将培养基吸出，加无血清培养基100 µL作为阴性对照，加顺铂100 µL作为阳性对照，其他给药组加入100 µL的供试品溶液，每组做4个平行对照于CO2培养箱中培养。24 h后，加入20 µL MTT溶液于黑暗中温育，4 h后，将培养基吸出，每孔均加入100 µL DMSO，用酶标法测定492 nm时的吸光度，结合下列公式计算地胆酶解物对肿瘤细胞的抑制率：
细胞抑制率=[1-（加药组吸光度-凋零组吸光度）/（空白组吸光度-凋零组吸光度）]×100%
3 结 果
3.1 酶解液中总氮含量
于570 nm紫外分光光度计处测定吸光度，所得回归方程为：y=0.0797x-0.0742（R2=0.998 4），在所测浓度范围内，甘氨酸浓度与吸光度具有良好的线性关系。
结合甘氨酸标准曲线进行计算，得到地胆水解液、胰蛋白酶酶解液、糜蛋白酶酶解液、弹性蛋白酶酶解液、胃蛋白酶酶解液氨基态氮的含量分别为4.461 8、5.879 4、6.727 5、5.086 4、7.336 8 mg++·g-1，胃蛋白酶酶解液中总氮含量最高，弹性蛋白酶酶解液中总氮含量最低，胰蛋白酶、糜蛋白酶酶解液中总氮含量介于两者之间。
经计算，胃蛋白酶的酶解度为13.11%，糜蛋白酶、胰蛋白酶的酶解度分別为10.31%、6.45%，弹性蛋白酶的酶解度为2.8%，见图1。
3.2 不同浓度梯度地胆供试品溶液对肝癌细胞BEL-7402的抑制效果
胰蛋白酶酶解液对肝癌细胞BEL-7402的抑制效果最好，抑制率为65.70%，地胆水提液在0.25～1 mg/mL范围内抑制肝癌细胞生长，其它浓度无抑制作用;糜蛋白酶酶解液、弹性蛋白酶酶解液、胃蛋白酶酶解液在任何浓度下对癌细胞的生长均无明显抑制作用，且浓度与抑制率成负相关，见图2。因此，肝癌细胞的最佳用酶为胰蛋白酶。
3.3 不同浓度梯度的地胆供试品溶液对乳腺癌细胞的抑制作用
胰蛋白酶酶解液对乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果相对较好，抑制率为37.85%，虽具抑制作用，但抑制效果较差;胃蛋白酶酶解液、弹性蛋白酶酶解液、糜蛋白酶酶解液等对乳腺癌细胞几乎无抑制作用且浓度与抑制率成负相关，见图3。因此，乳腺癌细胞MCF-7的最佳用酶是胰蛋白酶。
由图1、图2知，两种肿瘤细胞的最佳用酶均为胰蛋白酶。弹性蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶的抑制率随浓度增大抑制作用逐渐降低，胰蛋白酶酶解的小分子肽能够抑制肿瘤细胞的生长，弹性蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶酶解的小分子肽则对肿瘤细胞的抑制作用不显著，可能原因为药物浓度高，细胞被诱导产生耐药性或强酸环境下蛋白质被破坏，酶失去作用位点，药理活性降低等，另外，首过效应也应考虑[8-11]。本实验仅初步研究地胆粉的抗肿瘤活性，其抗肿瘤活性影响因素及作用机制尚未做深入研究，同时酶解受温度、酸碱度、时间、加酶量等影响较大，因此用酶提取有效成分疗效影响及残留问题等尚需进一步的研究，以期为地胆抗肿瘤活性成分研究提供实验依据[12]。
4 小 结
虫类中药地胆药用历史悠久，古籍中多次提到对肿瘤有抑制作用。地胆攻毒治癌的疗效在《名医别录》中记载，“蚀疮中恶肉、鼻中息肉[8]”。近年诸多药理实验表明地胆对原发性肝癌、乳腺癌、肺癌等病症具有良好疗效，抑制肿瘤细胞的生长繁殖，影响肿瘤细胞生长周期和促进肿瘤细胞凋亡等，但现代研究多从成分含量方面入手，酶解方面尚未有深入研究。大分子的蛋白质不能直接被人体吸收，经过人体内各种酶酶解为多肽或小分子氨基酸才能被人体利用[13]。本实验以地胆冻干粉为底物，模拟体外胃肠道消化系统以胃蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶4种蛋白酶进行酶解[14]，采用MTT法检测酶解产物对肝癌细胞BEL-7402、乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果[10]。体外药理实验表明：胰蛋白酶对肝癌细胞BEL-7402的酶解度为6.45%，对肿瘤细胞的抑制率明显高于对照组，且成剂量依赖性;弹性蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶酶解度分别为2.84%、13.11%、10.31%，对肝癌细胞无明显抑制作用;胰蛋白酶对乳腺癌细胞的酶解效果相对显著，但效果欠佳，其他酶几乎无效。因此，地胆混合酶解酶解度大小与抗肿瘤活性高低无明显关系;肝癌细胞、乳腺癌细胞的最佳用酶均为胰蛋白酶，且对于前者的抑制作用明显高于后者。综上本实验制备工艺简单，利用胰蛋白酶等4种蛋白酶进行水提酶解，测得对肿瘤细胞具有良好的抑制效果，为临床抗肿瘤等疾病治疗提供实验依据[15]。
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