摘要[目的]优化单酶复配酶解纤维素的条件。[方法]以经1 200 kGy 60Co γ-射线辐照处理过的玉米秸秆为原料，采用响应面分析法，对外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶等酶进行优化。[结果]4个因素对酶解产还原糖的影响主次顺序依次为木聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶。得到最优酶添加量为外切葡聚糖酶1.07 U/g、内切葡聚糖酶31.53 U/g、β-葡萄糖苷酶20.81 U/g和木聚糖酶81.96 U/g。在上述条件下，试验验证还原糖产量372.624 mg/g与预测值能够很好地吻合。[结论]该中心组合设计响应面优化单酶复配酶解辐照玉米秸秆的方法可靠，可为单酶复配提供参考。
关键词γ-射线辐照；响应面法；酶解；葡萄糖
中图分类号S216文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）10-0001-04
Optimization of Enzyme Complex Formulation of Irradiation Corn Straw by Response Surface Method
TENG Yanqi1，HU Qiulong2，3，SU Xiaojun2，3，JIN Yuanchang1，5* et al（1.College of Life Science，Hunan University of Science and Technology，Xiangtan，Hunan 411201；2.Hunan Engineering Laboratory for Alcohol Fuels from Biomass，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；3.Hunan Collaborative Innovation for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；5.Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metalpolluted Soils，College of Hunan Province，Xiangtan，Hunan 411201）
Abstract[Objective] To study the optimal ratio of enzyme complex formulation.[Method] 1 200 kGy 60Co γray irradiation corn straw as raw material，the response surface methodology was applied for analyzing the cellobiohydrolase，the endoglucanase，the βglucanase and the xylanase.[Result] The reducing sugar content was extremely significantly by xylanase dosage but not significantly impacted by cellobiohydrolase，βglucanase and endoglucanase.The optimum conditions for supplemental levels were found to be hydrolysis at cellobiohydrolase ratio of 1.07 U/g，endoglucanase ratio of 31.53 U/g，βglucanase ratio of 20.81 U/g and xylanase ratio of 81.96 U/g.The reducing sugar content under these conditions was 372.624 mg/g than before optimization and basically according with the model prediction value.[Conclusion] The optimization of enzyme complex formulation of irradiation corn straw by central composite design and response surface method is reliable，and it can provide reference for the complex of single enzyme.
Key wordsγray irradiation；Response surface method；Hydrolysis；Glucose
乙醇是生物質液体能源的主要形式，清洁可再生，是化石燃料的理想替代品[1-2]。在木质纤维素通过生物化学技术转化为乙醇及丁醇等燃料和高附加值的化学品的过程，一般包括预处理、水解、发酵、产物分离等操作部分，其中纤维素水解为可发酵糖起着关键性的作用[3-4]。纤维素的水解主要有化学法和酶法，从环保的角度出发，纤维素酶解作用是一条木质纤维素被彻底降解而不会对环境造成污染的有效途径，并且酶解反应有着糖损耗低、副产物少、条件温和等特点，因此备受关注[5]。
纤维素结构的复杂性决定了任何一种单一的酶都难以高效地水解它，能水解天然纤维素的纤维素酶是一个复杂的多酶体系。纤维素酶是生物降解纤维素生成葡萄糖一组酶的总称[6]，由内切葡聚糖酶（也称Cx酶）、外切葡聚糖酶（也称C1酶）、β-葡萄糖苷酶（也称CB酶）3个主要成分组成的诱导型复合酶系。当3个主要成分的活性比例适当时，就能完成对纤维素的降解[7-8]。木聚糖酶是一类木聚糖降解酶系，属于水解酶，主要用来降解含量仅次于纤维素的半纤维素[9]。
不同的单酶之间都存在着协同作用，研究它们之间的协同作用，有效地添加提高酶解率的酶，减少抑制酶解的酶，可提高酶解效率[10-12]。γ-射线辐照预处理是一种物理处理法，不需要高温高压等极端条件，副产物少，污染少，能够有效提高酶解效率[13]。有研究报道，γ-射线辐照预处理稻草、稻壳、麦秆、玉米秆、木屑等原料可有效提高酶的可及度，从而提高酶解产糖率[14]。
响应面分析法是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，通过局部试验回归拟合因素与结果间的全局函数关系而得到准确有效的结论，能在整个考察区域上确定各因素的最佳组合及最优响应值[15]。响应面分析法主要包括全因素设计、部分因素设计、中心组合设计和拉丁超立方设计等，最常用的是中心组合试验设计（CCD）和Box-Behnken试验设计（BBD）[16]。CCD是多因素5水平的试验设计，因素水平适用广泛，BBD一般适用于3水平试验设计。
筆者在纤维素辐照的基础上，通过单因素试验和响应面试验系统地研究了外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶复配对酶解辐照玉米秸秆的影响，探讨了最优添加量，以期为降低纤维素酶成本，优化酶系结构和纤维素的有效酶解提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料。玉米秸秆由湖南农业大学教学科研基地提供。
1.1.2试剂。冰醋酸、醋酸钠、 3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、无水亚硫酸钠、四水合酒石酸钾钠、苯酚均为国药集团化学试剂有限公司产品，所有试剂均为分析纯。内切葡聚糖酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶均由Sigma试剂有限公司提供，酶活分别为2.00、2.50、6.85、0.13 U/mg。
1.1.3仪器。Fz102微型植物粉碎机，天津市泰娇特仪器有限公司；ZHWY-2012C恒温培养振荡器，上海天域分析仪器制造有限公司；R0704135可见分光光度计，上海尤尼克试验有限公司。LD5-2A低速离心机，上海精密实验设备有限公司。
1.2试验方法收集田间干玉米秸秆晒干后，剪成3 cm左右小段，在室温下用60Co γ-射线进行辐照预处理，辐照剂量率为2 kGy/h，处理计量为1 200 kGy/h。经辐照后粉碎过20目筛，放入密封袋内保存。经辐照处理后，玉米秸秆中的纤维素、半纤维素、木质素分别由40.80%、30.85%、15.70%变为30.93%、17.26%、15.32%。辐照对玉米秸秆的纤维素和半纤维具有降解作用，对木质素降解影响不大。称取1 g辐照预处理玉米秸秆置于50 mL锥形瓶中，加入适量酶和0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 4.8），使其固液比为1∶20，充分摇匀，将上述三角瓶放入恒温培养箱中，在转速130 r/min、温度 50 ℃、pH 4.8、反应时间 72 h的条件下进行一系列试验。反应结束后，沸水浴终止反应，离心取上清液，上清液经适当稀释后用DNS法测定还原糖浓度，用离子色谱法测定葡萄糖浓度。
1.2.1不同酶酶解的单因素试验。
研究不同单酶酶解辐照玉米秸秆对还原糖浓度的影响。分别用不同浓度的外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶在相同条件下对辐照玉米秸秆进行酶解，用DNS法测定还原糖含量。
1.2.2响应面试验[17]。在单因素试验的基础上，应用中心组合试验设计，以外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶的酶添加量为因素，选用中心组合模型CCD，以葡萄糖含量为响应值，设计4因素5水平共30个响应面分析试验，试验因素与水平。
1.2.3还原糖测定。采用3，5-二硝基水杨酸法[18]。
2结果与分析
2.1不同酶解的单因素试验结果
2.1.1外切葡聚糖酶单独酶解辐照玉米秸秆。
由可知，外切葡聚糖酶添加量在1.17 U/g之前，随着外切葡聚糖酶添加量的增加，还原糖含量随之增加，之后趋于缓慢，且外切葡聚糖酶添加量对酶解的还原糖含量影响不大。
对试验结果二次拟合，得出还原糖含量与各因素关系方程：y=367.19-1.22A-2.29B-3.03C-3.45D-6.28AB-0.082AC-1.55AD-5.19BC-3.55BD+3.29CD-8.32A2-6.25B2-8.35C2-7.10D2。回归方程中各变量对响应值影响的显著性用F检验判断，P值越小，则响应面变量的显著程度越高，P<0.01时影响极显著，P<0.05时影响显著。
P>F，P值越小说明相应因素显著性越好，酶解还原糖含量的预测值与实际值拟合情况见图5，显示预测值和实际值拟合良好。该模型回归P<0.001，说明模型回归显著性可靠。失拟项P（0.462 2）>0.05为不显著项，失拟项有统计学意义，且该模型决定系数（R2）为0.959 5，校正系数（R2Adj）为0.921 7，说明该模型拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，试验误差较小。方差分析显示，4个因素的F值的大小顺序为D、C、B、A，得到影响响应值的酶大小次序为木聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶。
45卷10期滕彦淇等响应面法优化单酶复配酶解辐照玉米秸秆的研究
2.2.2因素间的交互影响。
采用DX8软件分析响应面数据，直观地给出了在2个因素的水平固定在中心点的情况下其余2个因素交互效应的响应面的3D分析图。内切葡聚糖酶与β-葡萄糖苷酶添加量对酶解还原糖含量的交互影响如图6所示。当固定外切葡聚糖酶和木聚糖酶添加量时，在β-葡萄糖苷酶和内切酶添加量较低时，还原糖含量随2种酶添加量的增加而增加，可能是玉米秸秆中的半纤维素被木聚糖酶降解，其对纤维素的包覆作用减弱，纤维素酶和纤维素液固异相反应的空间位阻降低，更多的纤维素被暴露出来，加快了内切酶和β-葡萄糖苷酶与底物的吸附、扩散速度和酶解速度，进而提高了酶解率。当添加量达到一定值时，随酶添加量的增加，酶解还原糖含量缓慢降低，可能是2种酶吸附在纤维素表面，形成竞争位点，阻碍了酶的水解程度。当内切葡聚糖酶添加量在30.00～32.00 U/g、β-葡萄糖苷酶添加量在18.00～21.00 U/g时，酶解还原糖含量逐渐增加并达到极大值。
外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶对还原糖含量的交互影响如图7所示。当固定内切葡聚糖酶和木聚糖酶的添加量，逐渐增大外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的添加量时，酶解还原糖含量会随之增大，但当这2个因素的添加量增加到一定程度时，酶解还原糖含量开始缓慢下降。外切葡聚糖酶与β-葡萄糖苷酶存在协同作用。当外切葡聚糖酶添加量在1.00～1.17 U/g、β-葡萄糖苷酶添加量在18.00～21.00 U/g时，酶解还原糖含量逐渐增大并达到最大值。
2.3最优条件预测及模型验证
根据响应面试验结果和回归方程，利用Design-Expert软件预测的最优条件，酶解还原糖最高值为368.092 mg/g，此时4个因素的取值如下：外切葡聚糖酶添加量为1.07 U/g，内切葡聚糖酶添加量为31.53 U/g，β-葡萄糖苷酶添加量为20.81 U/g，木聚糖酶添加量为81.96 U/g。
为了验证模型预测的准确性，在最佳酶添加量的条件下对辐照后的玉米秸秆粉末进行3次水平试验，实际酶解还原糖含量为372.624 mg/g，与模型预测值相近。
3结论与讨论
利用响应面进行优化，各因素对酶解产还原糖的影响从大到小依次为木聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶。得到最佳酶解添加量如下：外切葡聚糖酶添加量为1.07 U/g，内切葡聚糖酶添加量为31.53 U/g，β-葡萄糖苷酶添加量为20.81 U/g，木聚糖酶添加量为81.96 U/g。试验验证的实际值与模型预测值基本吻合，说明该模型真实可靠。研究结果表明，该中心组合试验设计响应面优化单酶复配酶解辐照玉米秸秆的方法可为单酶复配提供参考。
纤维素酶是由多种组分组成的复合酶系，各组分间如何发挥作用，目前普遍认可的酶解机理是协同作用模型。在协同降解过程中首先由Cx酶在纤维素的内部起作用，在纤维素的非结晶部位进行切割产生新的末端，然后由C1酶以纤维素二糖为单位从末端进行水解，再由CB酶将纤维素二糖水解为葡萄糖[20-21]。纤维素酶各组分间的比例及彼此相互协同作用对整个酶解过程影响较大，纤维素多组分协同作用比单一组分的水解效果要显著。
纤维素乙醇生产过程中酶法糖化工段的关键是降低纤维素酶的生产成本、投加量和提高酶解效率。多酶复配技术的目的是优化不同酶添加量及酶系相互协调作用来调控酶系的比例，使酶解更加充分进而减少酶用量并降低成本。该研究通過单因素试验和响应面试验，系统地研究了外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶进行复配对酶解的影响，得出最优添加量，指导实际生产应用。不同酶复配是增加生物质酶解效率的重要方法，经过复配酶间的相互协调作用明显增强。
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