【摘要】目的探讨同型半胱氨酸硫内酯（HcyT）对人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)的损伤作用及其可能机制。方法采用倒置显微镜、四唑盐（MTT）比色法及碘化吡啶（PI）染色流式细胞仪检测HcyT对细胞毒性作用，以荧光标记流式细胞仪检测细胞内反应性氧类(ROS)的生成。结果一定剂量HcyT刺激后，内皮细胞发生凋亡，且凋亡呈浓度时间依赖性。随着HcyT浓度的增加，ROS的生成逐渐增加。结论HcyT通过ROS呈时间浓度依赖性地 诱导内皮细胞凋亡，这可能是Hcy致血管病变的机制之一。
【关键词】同型半胱氨酸硫内酯;ECV304细胞;凋亡;反应性氧类
收稿日期：2005－01－06
作者单位：100853北京市，解放军总医院内分泌科
作者简介：谷伟军，女，1976年12月生，山西省大同市人，在读博士研究生 通讯作者：陆菊明，Tel:010－66939881
同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）是蛋氨酸代谢中间产物，众多研究表明高同型半胱氨酸是人类心血管疾病的独立危险因素。目前有一些Hcy致血管病变机制的研究，但其确切机制还不明了。近来有学者发现同型半胱氨酸硫内酯（homocysteinthiolactone,HcyT），氨基酰tRNA合成酶在编辑反应中形成的Hcy反应产物，它可能是Hcy致血管损伤的原因之一。一些研究表明HcyT的形成主要取决于体内Hcy、蛋氨酸、叶酸等的含量［1］。HcyT可诱导人HL60细胞的凋亡，给狒狒缓慢灌注HcyT可诱发动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)［2］。本研究旨在通过观察HcyT对培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）毒性、凋亡及细胞内反应性氧类(reactive oxygen species,ROS)产生的影响，从而为Hcy致病机制研究提供新的思路。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器L－同型半胱氨酸硫内酯(homocysteine thiolactone hydrochloride salt,LHcyT)，2,7二氯二氢荧光素双醋酸盐(2′, 7′dichlorofluorescein diacetate,H2DCF)均为Sigma公司产品,3(4,5二甲基噻唑2)2,5二苯基四氮唑溴盐（MTT）为Gibco公司产品;其它试剂均为国外或国产分析纯试剂。ModelBB5060CO2培养箱：上海Heraeus公司；IMT2相差倒置显微镜：日本Olympus公司；FACSCalibur流式细胞仪:美国BD;酶标仪:美国BioRAD公司。
1.2HUVEC株ECV304细胞接种于25cm2塑料培养皿，DMEM培养液(美国Gibco公司)和10%的胎牛血清（Hyclone公司），置于37℃5%CO2孵箱内培养。待细胞达对数生长期，分组实验。
1.3主要试剂的制备LHcyT溶于二甲基亚砜配成0.1mol/L储备液。H2DCF溶于无水乙醇，制备20mmol/L储备液避光保存。
1.4实验分组正常对照组：含10%胎牛血清的DMEM培养液；HcyT实验组：含HcyT终浓度为50～2000μmol/L的上述培养液。
1.5实验方法1.5.1倒置显微镜观察细胞生长状态。
1.5.2MTT法检测细胞活力消化细胞，调整细胞密度，将其均匀接种于24孔板，37℃CO2孵箱内培养，待细胞长满至70%～80%，加入LHcyT终浓度为50,250,500,1000,2000μm ol/L的培养液，同时设立正常对照。作用24,48,72h后，吸弃培养液，每孔加入40μlMTT（5mg/ml）,继续培养4h进行显色反应。弃上清，100%二甲基亚砜200μl/每孔，振荡摇匀，吸至96孔板，酶联检测仪测定490nm处的光密度值(OD)。细胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。
1.5.3流式细胞仪检测细胞凋亡①50,250,500,1000,2000μmol/L的LHcyT与细胞孵育48h后收集细胞，同时设立正常对照。②1mmol/LLHcyT与细胞孵育0,3,6,12,24h后收集细胞。碘化丙锭(propidiumiodide，PI)染色，氩离子激发PI荧光，激发光波长为488nm，发射光波长＞630nm，产生红色荧光，在G1/G0期前出现一亚二倍体峰细胞为凋亡细胞。获取细胞1×104/样品，用流式细胞仪检测凋亡细胞，获得凋亡率。具体方法：待检细胞70%的冰乙醇4℃固定过夜，PBS漂洗后，加PI(50μg/L)5μl，4℃避光染色15～30min，上流式细胞仪检测。
1.5.4琼脂糖凝胶电泳分析1mmol/L、2mmol/LHcyT与细胞孵育24h后，消化收集细胞，制成细胞悬液，常规酚/氯仿抽提，同时设立正常对照。紫外分光光度计测定DNA浓度， 1.8%琼脂糖凝胶，100V电泳40min。
1.5.5细胞内ROS检测20μmol/LH2DCF与50～2000μmol/LHcyT同时加入培养液中，37℃孵育24h后，收集细胞，冰PBS漂洗，置于冰上待检，流式细胞仪测定细胞荧光强度，每样品测定1万个细胞，用相对荧光强度表示细胞的相对氧化强度，反映细胞内ROS的含量，激光波长488nm,检测绿色荧光的波长范围为525nm。
2结果
2.1光镜下细胞形态的观察正常HUVEC形状为多角形，单层生长，呈典型的鹅卵石样镶嵌排列。高浓度HcyT作用24h后，可见细胞普遍收缩、间隙增大、细胞变小边圆，并有片状细胞脱失区。
2.2HcyT与细胞存活率细胞的存活率与HcyT呈时间和剂量依赖性关系，即随着培养时间的增加和剂量的增大，对细胞的毒性作用逐渐增强。较低浓度HcyT对细胞存活无显著影响，0.5mmol/LHcyT与细胞培养48h后表现出明显的细胞毒作用，2mmol/LHcyT在培养72h后对细胞存活率的抑制率最大（图1）。
2.4HcyT诱导HUVEC凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳1，2mmol/LHcyT组可见有“梯状带(ladder)”出现，而对照组无上述类似变化（图2）。
2.5HcyT对细胞ROS产生的影响流式细胞仪测定结果如图3，正常对照组细胞内相对荧光强度为32.12%，随着HcyT浓度的增加，细胞荧光峰值逐渐右移，0.05,0.25,0.5,1,2mmol/LHcyT所对应的荧光强度分别为38.59%、46.71%、50.58%、68.24%、79.32%。按照细胞内相对荧光强度变化，HcyT呈浓度依赖性地诱导细胞内ROS的产生。 图2HcyT诱导HUVEC凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳M:marker;1:正常对照；2:1mmol/LHcyT；3:2mmol/LHcyT；孵育24h
3讨论
细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种死亡形式,指细胞在生理或病理情况下发生有序的主动的非炎症死亡,又称程序性死亡。大量实验证实,易发生图3HcyT对细胞ROS产生的影响AS的局部血管的内皮细胞具有更新增加的现象,说明内皮细胞更新和此前的细胞凋亡与AS斑块形成有关。凋亡加速使内皮细胞更新增加,从而改变内皮细胞功能,诱发AS发生。血管内皮细胞的凋亡可能是AS形成的始发步骤［3］。由于凋亡细胞的DNA在内源性核酸酶的作用下裂解成200bp或与之成倍的寡核苷酸，故在细胞经去垢剂在膜上打孔后，小片段DNA会泄漏出来，因此凋亡细胞的DNA含量比正常细胞少，在经过染色后显示DNA峰时，会在正常2倍体DNA峰G1之前出现一个小峰A0，可以根据此峰的大小推测出发生凋亡细胞的量。本研究经PI染色流式细胞分析仪检测到亚二倍体的凋亡内皮细胞，且细胞凋亡率与HcyT呈时间浓度依赖性关系。细胞与1mmol/LHcyT共同孵育12h，即可发生显著性凋亡。凋亡细胞DNA在内源性核酸酶的作用下与核小体连接处发生断裂，DNA随之裂解成200bp或与之成倍的寡聚核小体。而坏死细胞中无这种核酸内切酶活化，其细胞DNA只是发生随机断裂。故而在核酸琼脂糖电泳时，凋亡的细胞DNA表现出一种特殊的，状如“楼梯”的电泳条带，而坏死细胞则无这种梯带出现。本研究核酸琼脂糖电泳结果证实HcyT可诱导HUVEC发生凋亡性损伤。目前，HcyT致血管病变的机制还不很明确，相关研究发现HcyT在体内还可与蛋白质发生反应，使其同型半胱氨酸化，同型半胱氨酸化低密度脂蛋白不仅易被巨噬细胞所摄取，还可以增加人主动脉血管内皮细胞的脂质过氧化损伤［4］。Jakubowski［5］发现人血管内皮细胞蛋白质同型半胱氨酸化程度依赖于Hcy/Met（依赖于叶酸）。
HcyT在体内代谢转化过程中，可以使生化反应中的自由基调控机制失活，导致ROS的生成与堆积。本实验以H2DCF为ROS捕获剂，直接显示细胞内ROS水平。结果显示，细胞内ROS水平随HcyT浓度增加而增加，且与细胞凋亡率相关，这提示ROS可能参与了HcyT诱导细胞凋亡的过程。ROS是介导细胞凋亡的物质，当细胞受到理化和生物因素刺激时，它通过细胞膜上NADPH氧化酶系统产生大量ROS。过多的ROS通过损伤DNA、蛋白质，脂质过氧化等多种途径诱发细胞发生凋亡［6］。
本实验结果显示HcyT通过ROS诱导细胞凋亡，这可能是Hcy致血管病变的机制之一。