工作原理、主要参数及数据处理、医学研究及应用、注意事项及日常保养这几个方面系统阐述流式细胞仪的使用。
【关键词】 流式细胞仪； 分选； 医学研究； BD FACSAria Ⅱ
中图分类号 R197.39 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2016）22-0160-03
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.22.086
流式细胞分析技术（Flow Cytometry，FCM）简称流式细胞术，是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术，常用来做细胞分析和细胞分选，广泛应用于医学基础研究、临床诊断以及疾病的监测等[1]。全球最早的一台流式细胞仪是在1973年由美国BD公司推出[2]，近年来，随着科技的发展创新和医学的进步，流式细胞仪的性能不断完善，操作日渐灵活，成为目前临床医学研究中不可或缺的检验工具。本文以BD公司推出的BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪为例，分别从仪器的基本结构、工作原理、主要参数及数据处理、医学研究及应用、注意事项及日常保养这几个方面系统阐述流式细胞仪的使用。
1 基本结构
流式细胞仪的基本结构主要包括四部分：流动室及液流系统、激光源及光学系统、光电管及检测系统、计算机及分析系统[3-5]。流动室是流式细胞仪的核心，主要部件有样品管、鞘液管和喷嘴。本实验室的BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪配有四中不同尺寸的喷嘴（70、85、100、130 µm），以满足不同微粒的需要。FCM的光源选择主要依据所用染料的激发光谱而定，本实验室的BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪配有三种波长的激发光（355、488、633 nm），最多可以检测9个荧光通道。
由一定波长的激发光激发出来的荧光信号需要经过光电倍增管（PMT）接收后转变为电信号，再经过放大器放大后才能被计算机检测。流式细胞仪一般配有两类放大器，一种是线性放大器，用于DNA测量；另一种是对数放大器，用于免疫学分析。BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪的很多功能及其数据分析都是由BD FACSDiva TM软件及其工作站来实现的。
2 工作原理
流式细胞仪主要用作细胞分析和细胞分选，将待测样品制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后装入样品管，由系统产生一定气体压力将样品管送入流动室，细胞悬液从样品管射出，样品管周围由鞘液包围，鞘液管与样品管成一定角度使得待测细胞在鞘液的作用下成单行排列，形成细胞柱，通过喷嘴与入射的激光束垂直相交，细胞或颗粒被激光激发产生荧光信号和非荧光散射信号，最终通过光学系统和检测系统处理后由计算机输出。由于各细胞或颗粒的大小、内部结构、理化性质、蛋白质含量、核酸（DNA或RNA）含量等的不同，使得接收到的荧光信号和非荧光散射信号也不同，从而实现对不同性质的细胞或群体进行分析和分类[6]。BD FACSAria Ⅱ流式细胞仪的工作原理示意图如图1所示。
流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。在分选过程中，仪器通过高频振荡对液流施加液滴驱动能量，使其断离为均匀的液滴，根据事先确定的分选标准由系统判断是否将被分选，由充电电路对选定的细胞液滴进行充电，当带电液滴通过电场时，会在电场的作用下向左或向右偏转，具体方向取决于液滴的电荷极性，未带电荷的液滴不受电场的影响，它们将在中心位置通过，最后进入废液抽吸器，发生偏转的液滴落入相应的收集器中，从而实现细胞分选[7]。一般来说，在进行较大或者脆弱细胞的分选时，为了得到最佳结果，应该使用较大的喷嘴和较低的压力；在分选较小或者非脆弱细胞时，如果要增加产量，应该使用较小的喷嘴和较高的压力。张立霞等[8]整理了应用FCM进行分选时遇到的问题及解决方案。
3 主要参数及数据处理
3.1 主要参数
流式细胞仪的检测信息主要来自特异性荧光信号和非荧光散射信号[9]。特异性荧光信号主要包括两部分：（1）自发荧光，即不经荧光染色，细胞内部的荧光分子自发产生的荧光；（2）特征荧光，即细胞经荧光染料染色后发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨。在实验中，为了减少自发荧光干扰，提高信噪比，常采用以下措施：①选用适宜的激光和滤片；②选用较亮的荧光染料；③采用荧光补偿，将自发荧光的本底贡献予以补偿。非荧光散射信号分为前向角散射（Forward Scatter，FSC）和侧向角散射（Side Scatter，SSC）。FSC与细胞的大小有关，其值与细胞直径成正比；SSC与细胞内部颗粒的性质有关，其值与细胞内颗粒的质量成正比。细胞的散射信号示意图如图2所示。
3.2 数据处理
FCM的数据处理包括数据的显示和分析，数据分析通常与结果的讨论有关，因此要根据所要解决的具体问题而定。BD FACSAria Ⅱ的数据显示方式主要包括单参数直方图、散点图、轮廓图和密度图等[10]。
3.2.1 单参数直方图 大多数实验所产生的数据都使用单参数直方图，X坐标表示荧光强度，Y坐标表示沿X轴某一特定荧光强度的细胞的相对数。单参数直方图既可用于定性分析，又可用于定量分析，但只能显示一个参数与细胞之间的关系。
3.2.2 散点图 散点图又称二维点图，X坐标和Y坐标分别表示与细胞有关的两个独立参数，是一种双变量描述，通过产生至少四种可能的结果来明确区分阴性和阳性，使对每一个标记物产生单阴性或双阴性反应的细胞与足够亮的单阴性或双阴性细胞没有重叠部分，统计学分析可以应用于被象限标记物划分出的四个细胞区，对应的四个象限分别为LL、UL、UR、LR。（1）LL（左下）：表示对于X轴、Y轴所代表的参数呈双阴性反应的细胞。（2）UL（左上）：表示对于Y轴所代表的参数呈阳性反应，而对X轴所代表的参数呈阴性反应的细胞。（3）UR（右上）：表示对于X轴、Y轴所代表的参数呈双阳性反应的细胞。（4）LR（右下）：表示对于X轴所代表的参数呈阴性反应，而对Y轴所代表的参数呈阳性反应的细胞。检测CD4/CD8细胞时就使用这种方法，散点图被分为若干象限，结果用整个散点图中出现在特殊象限的细胞占全部细胞的百分数来表示。
3.2.3 轮廓图和密度图 当分析的重点不是每个象限的细胞百分数，而是不同的细胞整体的活性带型时，应使用轮廓图和密度图来表示。轮廓图不仅可以判定阴性和阳性，还可以区分相对荧光强度所代表的活性。双参数轮廓图经常被用于白血病或淋巴瘤的免疫表型分析。
4 医学研究及应用
4.1 检测细胞凋亡
细胞凋亡（ apoptosis，Apo）是指细胞在一定生理或病理条件下，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，是为维持内环境稳定而主动争取的一种死亡过程。FCM对细胞凋亡的研究主要针对凋亡过程中DNA含量、质膜运输功能和通透性、线粒体膜电位、钙离子浓度等的变化进行检测，为医学基础研究提供了重要依据。李彦等[11]阐述了利用FCM检测细胞凋亡在药理学研究中的应用。李青鞠[12]探索了运用FCM来检测细胞凋亡的几种方法，包括DNA含量检测、AnnexinV-FITC/PI检测法、线粒体膜电位检测、钙离子浓度测定，分析讨论了每种方法的适用性和局限性。另外，李雪等[13]利用流式细胞仪的不同激发波长对人肺癌细胞的细胞凋亡进行了对比研究，证明可用407 nm激光器激发Hoechst33342来检测细胞凋亡。总之，在应用FCM检测前，应对检测方法进行有针对性的选择，必要时可结合多种方法进行检测，以提高检测效率。
4.2 检测细胞周期
细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。在生物细胞中，DNA含量随着细胞增殖周期的不同而发生变化，DNA非整倍体的出现提示机体有恶性转变的可能[14]。FCM对细胞周期的分析主要是对单个细胞内DNA含量的分析，章海荣等[15]利用荧光染料（Propidium，PI）与人体乳腺癌细胞DNA结合，实验显示被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。临床上主要是利用实体瘤标本或穿刺标本、胃镜、食管镜、肿瘤冲洗液、尿液等少量组织进行DNA 含量的测定，从而为临床肿瘤的诊断和治疗提供依据。
4.3 在临床细胞免疫中的应用
FCM在临床细胞免疫中的应用主要表现为对淋巴细胞亚群的测定[16-17]。淋巴细胞是机体免疫应答的重要细胞成分，分为T淋巴细胞（CD3）、B淋巴细胞（CD19）和NK淋巴细胞（CD16+56）三大群。T淋巴细胞又分为辅助性T细胞（CD4）和细胞毒性T细胞（CD8）。正常人T淋巴细胞CD4+/CD8+比值大约为2/1，比值升高表明机体免疫机能亢进，见于自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血等；比值降低表明机体免疫机能下降，如艾滋病、病毒感染、肿瘤、活动性肝硬化、再生障碍性贫血（AA）等。因此检测T淋巴细胞CD4+和CD8+的百分数有助于监测病人的免疫状态。
4.4 特异性标记物的检测
根据细胞表面或胞内特异性抗原的特点，结合不同荧光染料标记的抗体，利用FCM检测带有特异性抗原的细胞，对细胞因子及其受体作定性或定量分析。
5 注意事项及日常保养
（1）样品需制成单细胞悬液，且FCM对被检测样品的保存时间有要求，根据具体情况而定[18]。（2）选择正确的荧光染料，一般原则是：低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，高表达抗原标记低S/N（信噪比）荧光素。当样品用2种以上荧光染料时，为消除干扰，需要做荧光补偿。在应用流式细胞仪软件作荧光补偿时，补偿只应用在同一个激光激发的不同荧光素之间，应避免补偿不足和过度补偿[19]。（3）在进行上机前，所用溶液都要进行过滤处理，以免出现沉淀物而堵塞喷嘴。（4）开机待仪器状态稳定后，要先排除进样针内的气泡以保证喷嘴畅通，之后再对样本进行检测。（5）上、下样本管时，用力不要太大，以防止用力过大造成仪器光路偏移，影响测试结果。（6）每日关机前利用清洗程序对仪器进行清洗，以防喷嘴堵塞。（7）定期处理废液，定期清洗鞘液管路、废液管路和流动池，以防细菌生长。（8）做好仪器质量控制与生物安全管理，保证实验结果安全可靠[20]。（9）FCM仪器精密、价格昂贵，应放置于清洁、避光、干燥的仪器室内，并配上稳压电源。
流式细胞术作为细胞分析和分选的重要技术，在医学基础研究、临床诊断及科学研究中广泛应用，目前已成为现代生物医学和临床检验学最强有力的手段之一。随着人类的发展和科学技术的进步，FCM的技术会进一步完善，其应用领域也将会越来越宽广。
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