摘要 目的：采用牙龈黏膜下注射内毒素法构建大鼠上火牙龈炎模型，观察黄连解毒汤对大鼠上火牙龈炎的治疗作用。方法：雄性SD大鼠随机分为7组：正常对照组、溶剂对照组、上火牙龈炎模型组、黄连解毒汤低（0.25 g/kg）、中（0.50 g/kg）、高剂量组（1.00 g/kg）和甲硝唑芬布芬胶囊组。代谢笼喂养观测饮水量和尿量；LC-ESI-MS/MS法检测牙龈组织蛋白表达；生化试剂盒结合酶标仪检测牙龈组织氧化应激相关分子总超氧化物歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）和过氧化氢酶（Hydrogen Peroxidase，Catalase，CAT）的表达；Western Blotting法检测牙龈组织能量代谢相关信号通路TSC的表达。结果：上火牙龈炎时，大鼠饮水量和尿量减少，T-SOD和CAT表达水平降低，果糖二磷酸醛缩酶C、磷酸甘油醛异构酶1和TSC2均表达升高。黄连解毒汤可增加饮水量和尿量，升高T-SOD和CAT的水平，降低果糖二磷酸醛缩酶C和磷酸甘油醛异构酶1的表达，抑制能量代谢相关通路分子TSC2的表达。结论：黄连解毒汤可通过TSC信号通路和糖酵解相关分子抑制能量代谢，并抑制氧化应激，发挥治疗上火牙龈炎的作用。
关键词 黄连解毒汤；上火；牙龈炎；糖酵解；能量代谢；氧化应激
Abstract Objective：To evaluate the effects of huanglianjiedu decoration （HLJD） on the treatment of rat Shanghuo gingivitis by injecting lipopolysaccharide （LPS） in tooth-supporting tissues. Methods：Gingival inflammation was established by LPS injection. Adult male rats were divided into seven equal groups：control group （no treatment group）， negative control group （sterile saline was injected into gingival tissue followed by oral gavage with saline）， positive control group （LPS injection was followed by oral gavage with saline）， HLID low-dose， middle-dose， high-dose group （LPS injection was followed by oral gavage with HLJD）； metronidazole and fenbufencapsule （MFC） group （Oral gavage with MFC was followed by LPS injection）. After 3 days， the rats were sacrificed and gingival tissue samples were randomly evaluated by biochemistry method， LC-ESI-MS/MS and western blotting. Results：The levels of water intake， urine volume， total superoxide dismutase （T-SOD） and hydrogen peroxidase （catalase， CAT） in the model group were apparently lower than those in the control group. Meanwhile， fructose-bisphosphate aldolase C， triosephosphate isomerase 1 and TSC2 in the model group were significantly increased than those in the control group. HLJD could reverse those effects. ANOVA was used for the statistical analyses， with P<0.05 regarded as significant. Conclusion：HLJD treatment is effective in reducing energy metabolism and oxidative stress in induced rat gingivitis， resulting in a decreased level of fewer destructive effects.
Key Words Huanlian jiedu decoration； Shanghuo； Gingivitis； Glycolysis； Energy metabolism； Oxidative stress
中圖分类号：R285.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.004
牙周病是发生于牙周支持组织的慢性炎症性疾病，细菌感染是主要致病因素，已成为口腔疾病的常见病和多发病。根据炎性反应的轻重和波及范围，分为牙龈炎和牙周炎。若得不到及时治疗，将导致牙周组织不可逆损伤，牙齿松动脱落，严重者影响咀嚼功能，威胁着患者的生命质量。目前治疗方法除常规的洁治和刮治外，应用抗生素仍然是牙周病治疗的重要辅助手段，然而抗生素滥用导致细菌耐药和菌群失衡以及多种不良反应，因此开发天然药物越来越受到关注[1]。
黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoration，HLJD）出自唐代名医王焘《外台秘要》，是中医治疗火热毒症的经典方剂，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，具有清热、泻火、解毒之功效，主治实热火毒合三焦热盛之证。现代药理研究表明，黄连解毒汤具有抗炎、抗菌、抗内毒素、抗氧化、抗脑缺血、抗肿瘤、降血压、降血糖、降血脂、抑制脂肪细胞分化、抑制肝损害等作用[2-5]。
中医认为“上火”的产生，乃维持正常生命之气（火）相对发生偏盛，不管实热、阳虚、气虚、阴虚而生的火，均可称为“邪火”[6]。“上火”人群黏膜免疫系统异常，且“上火”损伤部位以头面部黏膜为主。“上火”多表现为口疮、牙宣、鼻衄、目赤、咽痛、口干等头面部黏膜病变[7]。本研究采用牙龈黏膜下注射内毒素法，基于中医“上火”理论模式，构建大鼠上火牙龈炎模型，观察黄连解毒汤对大鼠上火牙龈炎的疗效和作用机制[8]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性SPF级SD大鼠，体重（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物质量合格证号为SCXK2006-0009。
1.1.2 药物 将黄连、黄芩、黄柏和栀子按3∶2∶2∶3比例混合，中药粉粹机打粉。取定量粉末，加入10倍体积水，加热回流2 h。循环水式真空泵及布氏漏斗减压抽滤，得滤液1。滤渣加入10倍体积双蒸水再加热回流2 h，抽滤得滤液2，合并滤液1和2，减压浓缩至干，得黄连解毒汤粉末，每1 g粉末相当于原粉5 g[9]。
1.1.3 试剂与仪器 阳性对照药甲硝唑芬布芬胶囊（Metronidazole and Fenbufen Capsules，MFC，石药集团欧意药业有限公司产品生产，国药准字号H13024465），用于牙龈炎和牙周炎等疾患。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，北京索莱宝科技有限公司生产），临用时用生理盐水配成1 mg/mL浓度。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制作 将大鼠按体重随机分为7组，每组10只，如下：正常对照组（Control）：大鼠自由饮食，不做任何处理；溶剂对照组（Saline）：大鼠牙龈组织注射等体积生理盐水，然后口服生理盐水；上火牙龈炎模型组（Model）：牙龈黏膜下组织注射LPS，然后口服生理盐水；黄连解毒汤组（HLJD）：分为低（0.25 g/kg）、中（0.50 g/kg）、高剂量组（1.00 g/kg），牙龈黏膜下组织注射LPS，然后口服不同剂量的黄连解毒汤；阳性对照药组：牙龈黏膜下组织注射LPS，然后口服甲硝唑芬布芬胶囊溶液（MFC，甲硝唑31.25 mg/kg，芬布芬7.80 mg/kg）。
1.2.2 给药方法 大鼠经1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，用胰岛素注射器（美国BD，0.3×13 mm）在上下牙龈左、中、右黏膜下各3点注射脂多糖（LPS，1 mg/mL）10 μL，共注射6点，连续注射3 d。给药方式模型制作算为第1天，黄连解毒汤和对照药均为第1天给药，即模型制作完成后2 h灌胃给药，连续给药3 d，第4天处死动物，刮取牙龈组织。
1.2.3 检测指标和方法 1）饮水量和尿量的观测：模型制作前所有大鼠禁食禁水，按模型制作算为第1天，将大鼠装入代谢笼喂养，自由摄食和饮水，每天早10点装入200 mL饮用水，并计数饮水量和尿量，严格收集各组尿液和尿量，连续观察3 d。2）LC-ESI-MS/MS法：检测大鼠牙龈组织蛋白表达利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）法检测黄连解毒汤使用前后大鼠牙龈炎组织蛋白的表达。胰蛋白酶水解肽段，液质分析条件如下。液相条件：色谱柱为C18柱，（内径75 μm，外径360 μm，颗粒直径3 μm，流速350 nL/min。质谱条件：质谱仪为LTQ-OrbitrapVelos（Thermo），离子源为纳米电喷雾离子源，噴雾电压为1 800V，无鞘气，离子传输管温度350 ℃，扫描范围m/z375至1 600（m/z400时，分辨率为60 000），碰撞能量35%，激活时间5 ms，扫描阈值500。蛋白鉴定软件Proteome Discovery（V1.3），搜索工具MASCOT，搜索数据库RefSeq protein database（更新于2014年11月17日），质谱误差设置为20 ppm，母离子为0.5 Data，选择氧化和乙酰化可变修饰，氨基甲酰化固定修饰，蛋白鉴定假阳性率控制在1%。3）生化试剂盒结合酶标仪检测氧化应激相关分子：总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）的表达取各组大鼠牙龈组织，加入裂解液，16 000 g离心15 min，取上清，按照试剂盒操作说明，酶标仪（Molecular Devices，USA）检测样品吸光值（OD），按说明书公式换算成有效单位（U/mL）。4）Western Blotting法检测大鼠牙龈组织能量信号通路TSC的表达：取各组牙龈组织，加入裂解液提取总蛋白，Pierece蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取各样品20 μg上样，以10% SDS-PAGE胶分离蛋白，湿转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。封闭液室温封闭2 h，加入一抗，4度过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温轻摇2 h，充分洗涤后，用ECL显影曝光。
2 结果
2.1 黄连解毒汤对饮水量和尿量的影响 连续3 d观察对照组以及各用药组大鼠的饮水量和尿量，结果表明第1天各组大鼠饮水量无差异，模型组与正常对照组比较，尿量减少；第2天和第3天，各组大鼠饮水量和尿量都逐渐减少，模型组减少量最大；服用黄连解毒汤后，与对应的模型组比较，饮水量和尿量均有不同程度增加，并有统计学意义。见表1。
2.2 黄连解毒汤对牙龈组织蛋白表达的影响 LC-ESI-MS/MS法共检测2 997个蛋白，采用ANOVA分析法，结果表明54个蛋白差异有统计学意义（P<0.05）。将这54个蛋白进行分析，与牙龈炎相关的蛋白靶点可能为Fructose-bisphosphatealdolase C（果糖二磷酸醛缩酶C）和Triosephosphateisomerase isoform 1（磷酸甘油醛异构酶1）。牙龈炎时此2种蛋白均表达升高，黄连解毒汤低、中、高剂量组可降低上述2种蛋白的表达，对照药无该作用。
2.3 黃连解毒汤对牙龈组织氧化应激相关分子T-SOD和CAT表达的影响 生化试剂盒结合酶标仪对用药前后各组牙龈组织氧化应激相关分子T-SOD和CAT进行检测，结果表明上火牙龈炎时，对照组牙龈组织氧化应激相关分子T-SOD和CAT表达降低，服用黄连解毒汤后，T-SOD和CAT表达均升高，且具有量效关系。见图1。
2.4 黄连解毒汤对牙龈组织牙龈组织能量代谢相关通路TSC表达的影响 Western blotting检测大鼠上火牙龈炎牙龈组织TSC1、TSC2、p-TCS2等多种蛋白的表达，GAPDH为内参。结果表明上火牙龈炎时TSC2表达升高，其余蛋白表达无改变。黄连解毒汤低、中、高剂量组可抑制TSC2表达。见图2。
3 讨论
上火属于中医热证范畴，分为实火和虚火2类。实火指阳热亢盛，临床表现为面红目赤、口唇干裂、舌红苔黄、咽喉肿痛、牙龈出血、身热烦躁、尿少便秘、尿血便血、脉数实等等[10]。虚火多因内伤劳损所致，治疗则以清热泻火、滋阴降火等方法[11]。本研究用LPS注射法构建上火牙龈炎大鼠模型，模型大鼠饮水量和尿量均减少：1）一方面可能由于大鼠处于上火状态，体液失调；2）另一方面可能由于在牙龈黏膜下注射LPS，引起不适，影响进食和饮水。而黄连解毒汤可改善不适状态，使牙龈炎大鼠饮水量和尿量增多。
果糖二磷酸醛缩酶存在于多种组织中，是生命代谢过程中重要的糖酵解同工酶。其还可调节细胞膜P-糖蛋白将药物泵出，从而使DNA得以修复，还通过加快细胞内糖或带有糖支链物质的代谢，增加细胞解毒功能[12]。磷酸甘油醛异构酶能够催化丙糖磷酸异构体在二羟丙酮磷酸和D型甘油醛-3-磷酸之间转换。磷酸甘油醛异构酶在糖酵解中具有重要作用，对与有效的能量生成必不可少[13]。与牙龈炎相关的靶点主要为果糖二磷酸醛缩酶C和磷酸甘油醛异构酶1。上火牙龈炎时这2种蛋白均表达升高，表明牙龈组织的能量代谢有所改变，黄连解毒汤可通过能量代谢相关酶降低能量的产生。
氧化应激参与众多疾病如中风、老年痴呆、帕金森病以及牙周病的发生发展[14-15]。氧化应激过程中产生大量活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS），可通过脂质过氧化、DNA和蛋白质损伤、激活炎性反应因子以及关键酶的氧化等途径，造成牙龈组织损伤[16-17]。为研究牙周病患者体内的氧化应激和炎性反应状态，化学发光法检测牙周病患者血清及唾液中超氧化歧化酶（SOD）水平，结果表明牙周病患者SOD含量显著低于对照组，表明牙周病可能与体内的氧化应激水平密切相关[18]。本研究中上火牙龈炎大鼠氧化应激相关分子T-SOD和CAT水平降低，黄连解毒汤可通过提高T-SOD和CAT的水平发挥保护牙龈组织的作用。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）是非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为磷脂酰肌醇激酶相关激酶（Phosphatidy-linositol kinase-related Kinase，PIKK）蛋白质家族成员。mTOR进化上相对保守，可整合营养、能量及生长因子等多种细胞外信号，参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物过程，在细胞生长和凋亡中发挥极为重要的作用[19]。TSC1/TSC2是mTOR最重要的上游分子，mTOR活性主要受2种TSC-mTOR信号通路调节，即PI3K-Akt-TSC1/TSC2-mTOR信号通路和LKB1-AMPK-TSC1/TSC2-mTOR信号通路[20]。大鼠上火牙龈炎时TSC2表达升高，黄连解毒汤可抑制TSC2表达。
综上所述，上火状态时，牙龈炎时黏膜上皮组织糖酵解供能方式特别活跃，机体内环境的变化加重黏膜上皮组织缺血缺氧状态，使其糖酵解进一步活跃。能量代谢紊乱可导致黏膜损伤，使黏膜免疫系统供能紊乱，局部黏膜免疫力下降，易于继发感染[4]。此研究结果表明黄连解毒汤可通过TSC信号通路和糖酵解相关分子抑制能量代谢，并抑制氧化应激，从而起到治疗上火牙龈炎的作用，但其作用的具体机制还需要进一步研究。
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