【关键词】富血小板纤维蛋白;直接盖髓术;牙髓细胞
中图分类号：R781.05 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.015
直接盖髓术是保存活髓的有效手段，将盖髓材料覆盖于暴露的牙髓组织上，隔绝外界刺激，诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化，并为牙髓细胞提供附着空间，最终在穿髓孔处形成管状修复性牙本质，这是直接盖髓术理想的组织学表现。牙髓细胞可在各种细胞生长因子作用下向成牙本质细胞分化，而富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）可缓慢持续释放生长因子，进一步影响和引导牙髓细胞的增殖、分化过程。PRF膜已广泛应用于口腔领域，应用于直接盖髓术具有较大临床意义和广泛研究前景，但仍存在大量问题需要进一步研究，故本文对PRF膜用于直接盖髓术的相关研究作一综述。
1 直接盖髓材料简介
氢氧化钙（Calcium hydroxide，CH）作为直接盖髓材料长期应用于临床，曾作为衡量其他直接盖髓剂性能的金标准，但运用于临床仍有较大的局限性[1～2]。矿化三氧化聚合物（Mineral trioxide aggregate，MTA）是一种新型的盖髓剂，具有亲水性强、生物相容性及封闭性较好等特点。关于MTA与CH用于直接盖髓术的Meta分析发现，MTA具有更高的成功率，因其产生的炎症反应更低，而形成硬度更高的牙本质桥[3]。新型生物陶瓷材料不仅具有良好的生物相容性和封闭性，还有显著的抗菌作用且无细胞毒性，如iRoot BP具有与MTA相似的促进完整牙本质形成的能力，同时减少牙髓的炎症反应[4]。生长因子复合盖髓材料指生长因子与一定的载体材料复合作为一种盖髓剂，如以纳米晶体硫酸钙半水合物，羟基磷灰石和硫酸钙半水合物作为贮库，将转化生长因子β和血管内皮生长因子加入到贮库中形成缓释剂运用于直接盖髓术中，这些生长因子具有促进牙本质形成的能力[5～7]，但这些外源性生长因子难以获得，易被体内的蛋白酶破坏，费用高且异体生物材料存在潜在的排异反应。
2 PRF的制备、结构和成分
由Choukroun提出的PRF的制备方法如下：用真空采血管（不含任何抗凝剂）抽取10 mL静脉血，即刻在400 g（3000 r/min）离心力下离心10 min，静置5 min;离心后血液可以分成三层：上层为无细胞血浆，中间层为PRF，下层为红细胞层[8]。PRF的三维结构由纤维蛋白网构成，血小板和白细胞主要分布在红细胞和PRF凝胶之间的交界处，称为血沉棕黄层，此区域可以释放高浓度生长因子，PRF凝胶的提取物可以时间依赖的方式加速人牙髓细胞（human Dental Pulp Cells，hDPCs）的增殖[9]。He等[10]制备的PRF-hDPCs复合体保存了PRF的结构的完整性，而hDPCs分布于血沉棕黄层，证明此区域有可能是PRF最有效部位。在近细胞端纤维排列较致密，含大量血小板，胶原纤维排列成疏松多孔网状支架结构，α-颗粒释放于细胞和纤维之间，而有些α-颗粒未被释放，被网状纤维紧紧包裹，这些纤维对血小板激活起保护作用，随着纤维蛋白逐渐降解，血小板激活释放生长因子于纤维蛋白支架中，受胶原纤维保护抵抗蛋白降解，延长了生长因子效应时间。因此，PRF的纤维蛋白网状结构是其相对延长生长因子作用时间的结构基础，所含的大量白细胞可能具有很高的免疫学价值[11～12]。
PRF释放大量生长因子，其中转化生长因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）影响成牙本质细胞分化，同时上调与牙本质矿化相关的细胞外基質蛋白的基因表达，促进牙髓-牙本质复合体形成[13]。Lin等[14]研究发现经TGF-β1培养的牙髓细胞，环氧合酶-2和前列腺素产生E2的水平升高，此作用通过ALK5/Smad2/3和MEK/ERK通路实现，TGF-β1促进前列腺素产生E2的分泌，不仅影响牙髓的炎症反应，同时参与牙髓细胞的修复过程，这同时也提示了炎症反应是牙髓修复的早期标志。PRF释放人类骨形成蛋白（Human bone morphogenetic protein，hBMP），其中hBMP-2、hBMP-7可以明显增加牙髓细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，诱导牙本质涎磷蛋白表达，形成管样牙本质[15]。而将具有生物活性的蛋白，即生长因子应用于直接盖髓术是否对活髓保存的成功率有影响，Luiz等[16]对相关动物实验作了系统性评价，得出结论：在动物模型中，研究最多的蛋白是BMP-7、TGF-β1以及萃取可溶性牙本质基质蛋白;生物活性分子或材料可以促进第三期牙本质的形成，同时初始炎症反应更轻。如今，将具有促进牙髓细胞增殖分化的生长因子运用到盖髓材料中，成为盖髓材料研发的热点。
3 PRF作为直接盖髓术的机制、细胞学及临床研究
3.1 机制研究
PRF通过PI3K/AKT和MAPK信号通路促进牙髓细胞的增殖和蛋白合成[17]。另外，经PRF处理过的DPSCs高表达成牙本质基因和成骨基因，通过上调骨桥蛋白表达和促进ALP活性促进矿化。研究还发现PRF膜可以最少在1周内，最长可达28天，缓慢地、持续地释放重要的生长因子，意味着PRF可以自身结构为支架释放生长因子[18]。PRF可以增强成牙本质标志物相关mRNA和蛋白质的表达，如牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白-1，此外，PRF通过诱导具有时间依赖性的抗坏血酸和β磷酸甘油来激活ALP活性，促进矿化结节的形成[19]。不同浓度PRF浸出液对DPSCs的增殖、分化作用不同，杨盼盼等[20]在犬牙髓细胞的体外研究中发现，0.40浓度的PRF浸出液可促进cDPCs的增殖、趋化作用，但需进一步研究进行验证。
3.2 PRF膜用于直接蓋髓术的细胞学研究
PRF膜用于直接盖髓术有其细胞学及机制研究基础作为理论依据。有研究表明，在一定浓度范围内，洗涤血小板与富血小板血浆都可以明显促进大鼠牙髓细胞增殖及矿化[21]。PRF可抑制人牙髓细胞炎症反应，刺激成牙本质细胞的分化。Kim等[22]将脂多糖加入人牙髓干细胞（hDPSCs）的培养基中，以模拟牙髓组织因外伤或龋病所致细菌感染的炎症状态，研究发现PRF提取液可使hDPSCs中的IL-1β、IL-6和IL-8的表达下降，并抑制血管内黏着分子-1和细胞内黏着分子-1的表达，但牙本质涎磷蛋白表达量增加、ALP增强。
3.3 PRF膜用于直接盖髓术的动物研究
在2011年，Orhan等[23]将富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）用于大鼠切牙直接盖髓术的体内实验发现，成牙本质样细胞的数目与修复性牙本质的厚度均增加，认为PRP可以诱导大鼠内源性的修复性牙本质形成，但这种盖髓剂对于牙髓的损伤还要进一步研究。Puspita等[24]发现PRP可以作为一种诱导巢蛋白表达的直接盖髓剂，而巢蛋白是一种成牙本质样细胞特异性表达的蛋白质，为一种调节细丝蛋白，是成牙本质细胞的功能与分化的标志物，是与牙本质基质分泌能力有关的蛋白，即PRP用于直接盖髓术能使牙髓组织的成牙本质能力增强。而PRF作为第二代血小板凝聚物，其安全性优于第一代血小板凝聚物PRP，不像第一代的PRP，PRF的制备不需要加入牛凝血酶抗凝剂，因而更加简便、经济。
3.4 PRF膜用于直接盖髓术的临床研究
由于PRF膜的湿润、强度低的理化性质，PRF膜直接覆盖在露髓口上，表面湿度较大，其封闭性能较差，应用于临床直接盖髓术仍具有一定局限性。因此寻求一种具有良好生物相容性及封闭性的材料，将其与PRF膜联合应用于直接盖髓术成为复合盖髓剂的新选择。李响等人[25]以PRF/Dycal、Dycal及PRF分别作为盖髓剂对家兔门齿进行直接盖髓术，发现各组中均未见完整修复性牙本质桥形成，这与Moradi等[26]在2015年的研究结果相似，他认为相较于PRP以及Propolis树脂，MTA仍然是更佳的直接盖髓剂。分析其原因认为PRF组中直接用玻璃离子水门汀封洞，而玻璃离子对牙髓具有一定的刺激性，会引起牙髓坏死，而PRF/Dycal组氢氧化钙对PRF膜有一定毒性，且PRF和Dycal边缘封闭性差，因此需寻求一种与PRF膜具有更好生物相容性，同时具备良好的边缘封闭的材料至关重要。李威等人[27]将PRP与MTA联合作为直接盖髓剂，认为PRP与MTA复合盖髓具有良好的牙髓修复效果。Woo等[28]研究发现，相较于单独PRFe或MTA用于培养HDPCs，PRFe与MTA联合培养可上调HDPCs牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白-1的表达，提高ALP活性，且通过激动BMP/Smad通路促进人牙髓细胞向成牙本质细胞的分化以及矿化。Solomon等[29]在2015年在其病例报告中，将PRF膜联合Biodentine材料应用于5例17～20岁患者的5颗恒磨牙龋源性急性不可复性牙髓炎的冠髓切断术以保存根髓，结果术后第3、6、9、12、18、22和24个月复诊的临床检查以及影像学检查都表明活髓保存成功。冠髓切断术与直接盖髓术都是活髓保存的重要方法，Solomon团队将PRF膜应用于冠髓切断术的成功病例，恰恰证明了PRF膜应用于直接盖髓术也应具有较高的可行性。
4 总结
综上所述，具有稳定释放生长因子的生物材料是直接盖髓剂的发展趋势，PRF对牙髓损伤的修复作用尚面临着不少难点问题，比如PRF浓度的不同对于成牙本质效果的影响还未得出准确定论，但由于PRF具有来源丰富、取材方便、可由自体获得，相较于人工合成或外源性提取的生长因子具有更高的生物安全性、操作简单、费用低廉等优势，所以其在直接盖髓术的临床应用上具有广泛前景。
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（收稿日期：2019-07-03 修回日期：2019-08-16）
（编辑：潘明志）