摘要：建立安全的转基因家畜生产技术体系是保障人体健康和动物安全、保护生态环境、促进农业转基因生物研究和产业化的需要。从食品安全、环境安全以及家畜自身安全等３个方面分析了转基因家畜各生产环节可能影响安全性的诸因素，并从技术和管理的角度提出了解决方案。
关键词：家畜；转基因；安全性；解决方案
中图分类号：Ｓ８１４．８；ＴＳ２０１．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5562-05
应用转基因技术对家畜进行遗传改良，必将给畜牧业生产带来革命性的变化。与此同时，同其他转基因生物一样，其安全性也引起了广泛关注。世界各国纷纷加强对转基因生物安全性的研究，力图通过各种技术措施消除转基因生物的安全隐患，并制定相应法律、法规和制度对转基因生物的安全性进行管理。《农业转基因生物安全管理条例》（国务院，２００１）总则第一条指出：“为了加强农业转基因生物安全管理，保障人体健康和动植物、微生物安全，保护生态环境，促进农业转基因生物技术研究，制定本条例”［１］。根据对上述文字的理解，转基因家畜的安全性应包括３个方面：一是食品安全性，转基因家畜的主要产品是人类的食品；二是环境安全性，转基因家畜的环境释放会影响环境安全，也即生态安全的隐患；三是转基因家畜自身的安全性，家畜转基因之后，有可能会出现生存能力和适应性的变化。转基因家畜与转基因农作物相比发展滞后，到目前为止还没有大批量的商业化产品上市。然而转基因家畜的产生却已有２０多年的历史，有些已进入中间试验、环境释放和生产性试验阶段。随着中国“转基因生物新品种培育”重大专项的强力推进，其商业化生产已经为期不远。为促进转基因家畜试验研究和产业化的健康发展，本文根据中国《农业转基因生物安全评价管理办法》所涉及到的以及目前所能认识到的一些主要问题，提出转基因家畜安全性的解决方案，仅供参考。
１ 转基因家畜食品安全性的解决方案
可能影响转基因家畜食品安全性的因素主要有如下几方面：①转入基因的构件（包括目的基因、载体、标记基因等）及其表达产物；②非预期效应；③受体家畜的安全性。
１．１ 转入基因的构件及其表达产物
１．１．１ 目的基因及其表达产物 目的基因表达的蛋白是转基因家畜的目标产物，是可能影响食品安全性的直接因素。以高效、优质生产食品为目标的家畜转基因遗传改良，大体可分为如下几类：①提高畜产品的产量；②改善畜产品的品质；③提高家畜的抗病力；④加强环境保护，如降低磷的排放量等。
１９９３年，国际经济发展合作组织（ＯＥＣＤ）提出了食品安全性分析的原则——实质等同性（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）原则［２，３］，目前各国都以这一原则为基础，对食品包括转基因食品的安全性进行管理和评价。实质等同性的概念为：如果某种新食品或食品成分与现有的某一食品或成分大体相同，那么在安全性方面，两者可等同处理，即新食品与传统食品同样安全。按照实质等同性原则，转基因家畜中转基因编码的蛋白可分为两类：
一类是已经存在的某一食品成分，与现有的食品成分具有完全的等同性。例如：转基因猪高表达的ω－３不饱和脂肪酸酶，转基因奶牛表达的人乳清白蛋白、人乳铁蛋白等，这些都是已经存在于人类食品中的营养成分，具有安全性。
另一类是已经存在的食品中尚没有的成分，即所谓“新蛋白”。对人类健康有危害的蛋白有两类：一是毒素，即对人体有毒性的蛋白；二是可成为过敏原的蛋白。通过使用欧洲分子生物信息学网基因序列库ＥＭＢＬ、蛋白序列库ＳＷＩＳＳＰＯＲＴ，根据对毒素蛋白质和ＤＮＡ序列的查询，共发现各种毒蛋白１ ４５８种［４］。这为我们在选择目的基因时，排除毒蛋白的表达提供了依据。对于可能形成过敏原的蛋白，１９９６年国际食品生物技术委员会和国际生命科学研究所发展了一种称为“树型判定法”的程序来进行过敏原性分析［５］，２００１年再次对其作了修订。依照“树型判定法”，在设计转基因家畜目的基因时，应进行如下分析：①转基因的来源，如来自已知过敏原的材料，就避免用于转基因；②序列同源性，将转基因编码的蛋白与已知过敏原的氨基酸序列进行比较；③编码新蛋白的免疫化学分析，与有关过敏患者血清ＩｇＥ是否存在交叉反应；④耐酸性或耐消化性，多数过敏原能耐受胃酸和消化道蛋白酶的水解；⑤热稳定性或耐受加工处理，热不稳定的过敏原若在需经熟食处理、或经加工处理的食物中，则无需担心过敏性［６］。选择目的基因之后，还应对其表达产物进行毒理学评价。通过上述分析筛查和评价过程，可确保目的基因及其表达产物的安全性。
１．１．２ 载体 动物基因工程常用的载体有质粒载体和病毒载体，其中病毒载体的安全性受到广泛关注。构建转基因动物常用的是逆转录病毒载体，其中的慢病毒载体由于整合效率较高近年来得到快速发展。一般情况下通过包装细胞分泌的病毒已经丧失了自我复制的能力，但当病毒转染目的细胞后经过基因组整合，在一定条件下病毒转录表达的同时可以促使其相邻的目的细胞的某些基因也表达，若这些基因与辅助病毒的基因具有高度同源性的时候，将大大提高产生具有自我复制能力的逆转录病毒（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｒｅｔ ｒｏｖｉｒｕｓ，ＲＣＲ）的可能性［７］。用逆转录病毒为载体有可能在转基因动物体内合成新的感染性病毒［８］。逆转录病毒载体的插入还可能会激活附近的内源性基因表达，从而触发被转染细胞的表型转变［９］，这称之为“插入诱变”。插入诱变可能发生最严重的副作用是诱导癌基因的表达。尽管有些逆转录病毒载体（例如第二、第三代慢病毒载体）已经进行了改造，其安全性大大提高，但对病毒载体的使用仍需持谨慎态度。
１．１．３ 标记基因 标记基因（Ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ）是选择标记基因（Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ）的简称，可分为两类：一类是指其编码产物能够使转化的细胞具有对抗生素的抗性，在培养基中加入抗生素等选择试剂，非转化的细胞死亡或生长受到抑制，而转化的细胞能够继续存活，从而将转化的细胞从大量的细胞中筛选出来的一类基因。构建转基因动物常用的这类标记基因有ｋａｎ（卡那霉素）、ａｍｐ（氨苄青霉素）、ｎｅｏ（氨基糖苷磷酸转移酶基因）、ｔｋ（胸腺嘧啶激酶基因）等。另一类也称报告基因（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ），是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导人受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。目前转基因动物常用的报告基因是ＧＦＰ（绿色荧光蛋白基因），由ＧＦＰ衍生出来的还有ＢＦＰ（蓝色荧光蛋白基因）、ＹＦＰ（黄色荧光蛋白基因）等各种可视光的荧光蛋白基因。
转基因成功之后，这些标记基因留在转基因个体中，并随着转基因个体的扩群繁殖传递给后代。这些带有标记基因的动物及其产品是否具有不安全的因素，还需要大量的试验和时间来证明。但可能的食品安全隐患有如下几方面：①当人们食用了转基因动物的产品，标记基因编码蛋白有可能被转移到人体的细胞或肠道微生物中，从而可能会降低抗生素在临床治疗中的有效性；②标记基因编码蛋白是否会成为新的致敏原，尚不得而知；③报告基因的存在会让消费者产生一种心理排斥反应。
标记基因的功能是把转化的和未转化的细胞、组织区分开。但是，一旦完成筛选得到所需要的转化细胞、或完成转基因动物的构建之后，标记基因就变成不需要的和多余的。为了消除标记基因的安全隐患，目前我们能够采取的解决方案：一是在筛选转化细胞或构建成功目的基因表达的动物之后，剔除标记基因；二是使用无标记基因的转基因技术。
位点专一性重组系统能有效地对目标基因进行剔除，目前可用于动物基因剔除的有Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ和ＦＬＰ／ｆｒｔ系统，其中以Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ应用较多。Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ系统是利用Ｃｒｅ重组酶的重组特性，将选择标记基因置于两个Ｌｏｘｐ位点之间，目的基因置于Ｌｏｘｐ位点之外，通过Ｃｒｅ蛋白的识别重组，使两个Ｌｏｘｐ位点之间的ＤＮＡ区段与动物基因组之间发生置换，从而剔除选择标记基因，获得只含有目的基因的转基因动物［１０］。ＦＬＰ／ｆｒｔ与Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐ重组原理基本相似，也是利用ＦＬＰ基因编码的重组酶，可以识别ｆｒｔ位点并进行重组［１１］。
无标记基因的家畜转基因技术其实早已有之，先期建立的显微注射、精子介导等方法，都可以不使用标记基因，而是依靠分子生物学技术在个体水平或胚胎水平上进行筛选。其中又以原核的显微注射法重复率高，效果可靠。只是这些方法导入的外源基因一般是随机整合的，后期筛选的工作量大。
１．２ 非预期效应
非预期效应指的是在考虑了目的基因插入产生的预期效应的情况下，转基因与非转基因亲本（在相同环境和条件下）在表型、反应和组成上所显示出的统计学显著的差异［１２］。转基因植物的非预期效应一般认为是由于外源基因的随机整合所导致。根据已有转基因家畜研究的情况分析，可能引发转基因家畜非预期效应的因素主要来自于两方面：①外源基因的随机整合；②某些种类目的基因的非可控表达。
１．２．１ 随机整合引发的非预期效应 随机整合是指外源基因不受人为控制，随机地插入任意染色体的任意位置。研究表明，转基因生物由于外源基因的随机插入，可能通过以下几种机制改变内源基因的表达进而导致非预期效应的产生：①外源基因插入内源基因的“阅读框”，破坏基因的核酸序列使其不能有效表达；②外源基因插入内源基因调控元件的“功能区”，使调控基因失去功能，导致受其调控的内源基因不能有效表达；③外源基因插入基因组的某个“敏感域内”，使原本“沉默”的内源基因被“激活”而高效表达；④外源基因的转录或表达产物成为诱导或抑制内源基因表达的活性因子，直接或间接地使这些内源基因的表达发生质或量的改变［１３］。无论哪一种原因引起转基因生物细胞成分的改变，都将导致食品成分的改变，而食品成分的任何一种改变都会与人类健康密切相关。因此随机整合引发的非预期效应是引起食品安全性问题的重要原因之一。
解决转基因家畜随机整合的方案，就是采用基因打靶技术，将事先设计好的ＤＮＡ序列插入选定的目标基因座，或者用事先设计好的ＤＮＡ序列去取代基因座中相应的ＤＮＡ序列，即实现定位整合（或靶向修饰）。目前，已建立的家畜基因组靶向修饰技术有：体细胞核移植途径的靶向修饰技术、锌指核酸酶（ＺＦＮｓ）介导的靶向修饰技术和ＰｈｉＣ３１整合酶介导的靶向修饰技术。相对于体细胞介导的基因组靶向修饰，ＺＦＮｓ技术和ＰｈｉＣ３１整合酶技术具有如下优势：①效率高，相比传统的同源重组方法提高了３～４个数量级；②不需要药物筛选，不引入标记基因，省却了删除标记基因的繁琐程序；③可以在胚胎水平上进行基因导入，通过简单的显微注射技术即可获得靶向修饰的转基因动物。除此之外，ＺＦＮｓ技术还有可能实现双等位基因的靶向修饰，能够一次性得到纯合子个体，这对于转基因家畜育种尤其有利。
１．２．２ 目的基因非可控表达引发的非预期效应 目的基因的非可控表达，包括过量表达、非特定发育阶段的表达以及非组织特异性的表达。某些种类目的基因（如生长激素类基因）的过量表达有可能影响转基因家畜的健康和食品的安全性。如：２０世纪８０年代，将生长激素类基因导入家畜，有少数转基因家畜由于激素表达量过高而导致生长发育不正常［１４］，过量激素的蓄积还可能影响食品的安全。有些基因在胚胎阶段或幼畜阶段表达，有可能导致胚胎或幼畜发育的不正常。转基因随着胚胎的发育进入到各种组织细胞并在各种组织中表达，有些基因的表达产物会对其他组织基因的表达产生干扰，从而影响转基因家畜的健康和食品的安全性。因此，调控某些基因的表达量、调控其在发育的特定阶段和特定组织中进行表达就很有必要。转基因可诱导表达系统和组织特异表达系统为上述问题提供了解决途径。
目前用于家畜可诱导表达比较成熟的是四环素（Ｔｅｔ）诱导表达系统，该系统相当于转基因表达的开关，在需要的时段在家畜的饲料中添加诱导剂使基因开启，不需要的时候去掉诱导剂、沉默子抑制目的基因的表达使基因关闭。转基因动物中外源基因的组织特异性表达依赖于组织特异性表达基因的启动子和上游调控区，可以通过不同启动子的选择，使目的基因实现特定时间和特定器官组织的表达。例如乳腺特异性表达载体需要三部分有效的构件：乳蛋白基因启动子及５′上游调控区、目的基因和包含ｐｏｌｙ（Ａ）信号的基因３′端及下游区。乳蛋白基因的５′上游调控区包含有激素应答元件等时空特异表达调控位点，能准确地控制目的基因表达的特异组织（乳腺）和时间阶段。
１．３ 受体家畜的安全性
受体家畜的安全性无疑对转基因家畜的安全性产生最直接的影响。考古研究表明，早在新石器时代，人类就开始饲养家畜，家畜作为人类的食品至少已有６ ０００～７ ０００年的历史，其自身并无安全性的问题。但有些携带人畜共患传染病原的家畜，会将病原传染给人类，可对人类健康产生不利的影响；携带其他传染病原的家畜会危害转基因家畜的健康。因此，用于转基因受体的家畜必须进行严格的检疫，携带人畜共患传染病原或其他传染病原的家畜不能用作受体。为了防止病原的感染，作为转基因受体的家畜应在相对净化和隔离的环境下饲养，同时应做好严格的免疫接种、消毒、卫生等防疫工作。
２ 转基因家畜环境安全性的解决方案
转基因生物的环境或生态安全风险，是通过基因漂移实现的。基因漂移有２种方式，即基因的垂直漂移（Ｖｅｒｔｉｃａｌ ｇｅｎｅ ｆｌｏｗ）和水平转移（Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）［１５，１６］。
基因水平转移通常指基因在亲缘关系很远的物种之间进行交换和移动，多发生于微生物的物种之间。可能引起转基因家畜基因水平转移的途径有以下几种：①肠道微生物。转基因家畜的外源ＤＮＡ与肠道微生物进行基因交换重组，从而发生转移并形成新的致病微生物；②畜舍内的其他动物，如蚊、蝇、老鼠等。当蚊吸食转基因动物的血液之后，再吸食其他动物的血液；蝇、老鼠食用了转基因动物的排泄物之后，再四处飞行或流窜，从而发生转移；③排泄物。转基因家畜的粪便施放到田地作为肥料，其中可能含有未降解的细胞或细胞碎片。分析上述①的途径，整合在动物基因组的外源ＤＮＡ，如果能发生与肠道微生物进行基因交换重组，其实与内源基因是等同的。但肠道微生物是伴随着动物的出现就一直存在的，并未见动物的ＤＮＡ与肠道微生物ＤＮＡ发生交换重组的现象，也不具备这种机制。已知微生物之间可通过转导、转化或接合进行基因转移，但尚无裸露ＤＮＡ在肠胃系统中转入微生物的报告［１７］。至于上述②、③的途径，显而易见，圈养的动物与在大田里生长的植物相比，上述可能引起基因水平转移事件发生的概率要低得多。就转基因生物安全的风险评价而言，风险是危害性及其发生概率的函数，即：风险＝危害性×发生概率。即使对于植物，目前也还没有充足的证据表明，基因的水平转移会导致转基因逃逸和带来明显的环境安全问题［１５］。
基因的垂直漂移是指通过有性杂交的方式发生于亲缘关系很近或同一物种不同群体之间的基因交换。转基因植物的基因垂直漂移，通常可以通过３种不同的媒介来实现，即花粉介导、种子传播介导和无性繁殖器官介导的基因漂移［１５］。家畜（哺乳动物）与植物不同的是，其受精过程是在体内完成的，不存在如转基因植物由于花粉或种子介导的“基因漂移”问题；同时家畜在自然状态下不能进行无性繁殖，也不存在无性繁殖器官介导的基因漂移。惟一可能造成基因垂直漂移的途径，就是转基因家畜的逃逸。转基因家畜从圈舍内逃出，与非转基因家畜交配，从而造成转基因的逃逸。而防范转基因家畜的逃逸，可以通过如下措施加以控制：①转基因家畜的研发或生产必须在专用的圈舍内进行；②转基因家畜的畜舍与非转基因家畜的畜舍之间要有严格的隔离设施和隔离带；③按照中国“农业转基因生物及其产品安全控制措施”的规定，制定严格的防止转基因家畜逃逸的管理制度和应急措施。
３ 转基因家畜自身安全性的解决方案
转基因家畜自身的安全性，根据《农业转基因生物安全评价管理办法》附录ＩＩ“转基因动物安全评价”［１８］，可理解为相对于受体家畜，其存活能力、繁殖、遗传及其他生物学特性的改变。从转基因动物生产过程到外源基因的表达，都有一些影响转基因动物自身安全性的因素。本文的第一部分可能影响转基因家畜食品安全性的因素中，已经涉及到一些影响转基因家畜自身安全性的因素，其中比较重要的是载体和非预期效应。除此之外，转基因方法也对转基因家畜自身的安全性产生一定的影响。现有的每一种转基因家畜制作方法都存在自身的一些缺陷。显微注射法、精子介导法、病毒感染法以及其他非同源重组的方法，外源基因一般是随机整合，整合位点的不确定性可能带来非预期效应，不仅影响食品安全性，也影响转基因家畜自身的安全性，而且首先表现的是对转基因家畜自身安全性的影响。病毒感染法还存在病毒载体带来的安全性隐患。体细胞核移植介导的转基因方法，与基因打靶技术相结合，虽然能实现定位整合（靶向修饰），但其产生的部分克隆动物确实存在健康问题。体细胞核在卵胞质中重编程的不完整性（或其他原因），有可能会导致部分转基因动物其解剖结构、生理功能和行为方式上的些许改变，这些变化可能会对动物自身的健康造成影响和存活能力的下降，如死胎、胎儿肥大、早期流产、成年后表型和解剖学异常等现象［１９］。
上述问题的解决方案可以从两方面考虑：其一是对不管是用哪一种方法获得的转基因家畜，都应加强生长发育、繁殖、遗传及各种生物学性状的监测和评估。对于用作生物制药的转基因家畜，在动物血液中是否有药物的残留、药物的实际含量，对动物消化系统中的微生物菌区的微生物是否有一定影响，是否对该种药物产生特定的抗药性都应仔细监测。通过监测和评估，淘汰有异常表现的个体，保留具有正常生长发育态势、繁殖和遗传稳定的个体。已有的转基因动物的试验表明，出现上述存活能力下降的只是少数。其二是改进现有的转基因技术，使其更具安全性。例如：通过显微注射途径的ＺＦＮｓ技术和ＰｈｉＣ３１整合酶技术，既可以实现靶向修饰，又可以规避目前克隆技术的一些弊端。从能在细胞水平上对转基因的整合和表达进行筛选而言，体细胞介导的转基因方法仍有不可替代的优势，目前应着力研究体细胞重编程的机理，提高完整重编程的效率，从而提高克隆效率、减少转基因克隆家畜的异常。
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