摘 要 为获得杀线虫Bt菌株YC10最佳培养基配方，以发酵液中伴胞晶体蛋白浓度为评价指标，利用PlackettBurman实验设计和响应面分析法对YC10的培养基配方进行室内摇瓶优化筛选.实验结果表明：大豆饼、玉米粉、氯化钙和磷酸氢二钾为4个显著影响因子，YC10最优培养基配方为：黄豆饼25.73 g/L，玉米粉12.57 g/L，CaCl2 0.25 g/L，K2HPO4 0.43 g/L，ZnSO4 0.20 g/L， MgSO4 0.20 g/L，MnSO4 0.25 g/L，FeSO4 0.25 g/L.
关键词 苏云金芽胞杆菌；培养基优化；响应面分析法；伴胞晶体蛋白
中图分类号 Q936 文献标识码 A 文章编号 10002537（2016）04002306
Optimization of Fermentation Medium of Bacillus Thuringiensis
YC10 by Response Surface Methodology
CHENG Feixuea， SONG Zhiqianga， WANG Jianb， WANG Zhongyonga， CHENG Juea， ZHANG Deyonga*， LIU Yonga*
（a.Institute of Plant Protection， b. Hunan Agricultural Economy and Regional Planning Research Institute，
Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）
Abstract The optimization of fermentation medium for crystal protein production by strain YC10 of Bacillus thuringiensis was investigated. Firstly， four of the most significant influence factors were screened by the method of PlackettBunnan design as soybean meal， corn starch， CaCl2 and K2HPO4. Then， the optimal combined concentration and mutual effect of four factors were optimized by response surface methodology. Our results showed that the best medium composition was soybean meal 25.73 g/L， corn starch 12.57 g/L， CaCl2 0.25 g/L， K2HPO4 0.43 g/L， ZnSO4 0.20 g/L， MgSO4 0.20 g/L， MnSO4 0.25 g/L and FeSO4 0.25 g/L.
Key words Bacillus thuringiensis； media optimization； response surface methodology； parasporal crystals
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）作为一种安全的生物农药[1]，是目前世界上开发应用最成功的微生物杀虫剂，被广泛应用于农业、林业、贮藏以及卫生等多种害虫的防治[2].Bt菌株的杀虫毒力取决于发酵液中伴胞晶体蛋白的产生.而其发酵培养基的组成成分不仅影响发酵时菌体生长，还直接影响菌株蛋白晶体蛋白的产量，从而决定其杀虫效果，特别是培养基中的碳源、氮源和无机离子的组成及其配比对伴胞晶体蛋白的产生影响极大[3].而目前生产中常用的Bt发酵培养基配方并不能适用于所有的Bt菌株，往往会出现因发酵培养基中组分及配比不恰当而使得Bt菌株的伴胞晶体蛋白含量不高，从而影响其杀虫效果，限制其在农业生产上的应用.所以进行Bt菌株发酵培养基组分的选择和配比优化对提高菌株伴胞晶体蛋白的产量极其重要.
响应面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是一种优化生物过程的统计学实验设计方法，是简化实验过程、降低开发成本、优化实验条件、提高生产效率和解决生产实际问题的有效方法.目前国内外利用响应面分析法在微生物发酵培养基的筛选优化中取得了很好成效[45].
Bt菌株YC10是一种对植物线虫具有较强杀虫作用的活性菌株[6]，本研究采用PlackettBurman设计和响应面分析法，以发酵液中伴胞晶体蛋白含量作为评价指标，对该菌株的发酵培养基进行筛选与优化，以提高该菌株伴胞晶体蛋白产生量，从而提高其杀线虫效率，为该菌株的工业化生产及其在农业生产上的应用提供指导.
1 材料和方法
1.1 供试菌株
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis， Bt）YC10菌株，为本实验室分离保存菌种.
1.2 菌种培养方法
将芽孢杆菌单菌落接种到装有60 mL NA培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃，200 r/min摇瓶培养10～16 h，取4 mL转接到装有100 mL基础发酵培养基的500 mL三角瓶中，相同条件摇瓶培养至镜检80%芽孢脱落时停止培养，作为发酵实验菌种备用.
1.3 发酵效果检测
伴胞晶体蛋白提取采用等电点法[6]，含量测定采用Bradford法.
1.4 发酵培养基的筛选
Bt培养过程中，培养基成分中氮源、碳源、无机离子（锌离子、镁离子、钾离子、钙离子、亚铁离子、锰离子）质量浓度对伴胞晶体蛋白影响较大[79].培养基筛选优化各实验的处理都采用500 mL锥形瓶中装50 mL培养基， 菌种接种量2%，200 r/min，30 ℃摇瓶培养96 h，以各处理所得伴胞晶体蛋白含量为响应值.
1.4.1 PlackettBurman设计 在查阅文献的基础上，根据BoxBehnken原理进行PlackettBurman设计，筛选对Bt伴胞晶体蛋白产生显著影响的培养基成分.实验设8因子、2水平（标记为+1，-1），12个处理（见表1）.各成分的质量浓度以Xn表示：黄豆饼（X1），玉米粉（X2），硫酸锌（X4），硫酸镁（X5），硫酸锰（X7），氯化钙（X8），硫酸亚铁（X9），磷酸氢二钾（X10），X3，X6和X11代表虚拟因子以减少实验误差.
1.4.2 最陡爬坡实验 在PlackettBurman实验基础上，利用最陡爬坡路径法对显著影响Bt菌株YC10伴胞晶体蛋白产生的因子进行最陡爬坡试验研究.以试验结果中概率值（Pvalue）小于0.05的黄豆饼、玉米粉、磷酸氢二钾和氯化钙4个培养基组分的质量浓度作为主要影响因子、5水平标记（-2，-1，0，1，2）进行最陡爬坡实验设计，以确定培养基中显著影响因子的浓度范围.
1.4.3 响应面分析 以最陡爬坡试验得出的实验结果为依据，进行BoxBehnken设计，用Design Expert软件对实验结果进行回归及误差分析，获得回归方程，并根据回归方程绘制响应面分析图，进而确定最佳培养基配方，求得最优值.
1.4.4 实验验证 用得到的最佳培养基配方进行3次平行实验，取得平均值，与预测值进行比较以验证模型的可靠性，进而得出最终优化结果.
1.5 结果统计与数据分析
实验结果统计以实验处理组的伴胞晶体蛋白含量为响应值，每次试验重复3次.PlackettBurman实验和响应面实验运用Design Expert统计软件（Version 8.0.7.1，StateEase Inc.，USA）进行方差分析（ANOVA），F检验（Ftest）.
2 结果与分析
2.1 显著影响因子分析
PlackettBurman实验设计结果表明，黄豆饼、玉米粉、磷酸氢二钾、氯化钙4个培养基组分对Bt菌株YC10产孢作用影响显著（P<0.05），对伴胞晶体蛋白含量的影响从大到小依次为黄豆饼、磷酸氢二钾、玉米粉和氯化钙（表2）.
2.2 显著影响因子最适宜浓度范围
PlackettBurman实验分析结果可以看出，高水平的黄豆饼和玉米粉对Bt菌株YC10伴胞晶体蛋白的产生起促进作用，而高水平的氯化钙和磷酸氢二钾则对伴胞晶体蛋白生成产生抑制作用.因此在最陡爬坡实验中对4种显著影响因子的质量浓度进行了适当调整，以寻找能产出最高伴胞晶体蛋白量的培养基组分.最陡爬坡实验结果（表3）显示，能获得最高伴胞晶体蛋白量的培养基组分初步确定为黄豆饼25.0 g/L，玉米粉12.5 g/L，氯化钙0.25 g/L，磷酸氢二钾0.45 g/L.
2.3 响应面法筛选最优培养基组分
在爬坡实验基础上通过响应面法中的BoxBehnken方法对4种培养基成分进行最优筛选，以黄豆饼250 g/L，玉米粉12.5 g/L，氯化钙0.25 g/L，磷酸氢二钾0.45 g/L为中心点进行响应面实验设计与分析（表4和表5）.从表5中可以看到，该回归模型多元相关系数R2为0.973 2，表明仅有2.68%的变异不能由此模型进行解释；同时，回归模型P值小于0.000 1，表明模型显著.经回归拟合，得到二次多项式方程：Y=171.50+10.80A+3.46B-2.23C-5.61D-6.20AB+3.90AC+1.45AD+2.75BC-1.08BD-0.85CD-1665A2-13.37 B2-8.90 C2-8.32 D2（其中Y为伴胞晶体蛋白质量浓度）.
根据上述拟合回归方程做出响应面分析图，见图1～图6.从图1可以看出，当培养基中CaCl2为025 g/L，K2HPO4为0.45 g/L时，使黄豆饼从22.5 g/L增加到27.5 g/L，玉米粉从11.5 g/L增加到13.5 g/L，产生的伴胞晶体蛋白均呈现先增加后减少的趋势，曲面顶点为产生的伴胞晶体质量浓度最大值.同样，图2和图3也显示，随着黄豆饼和CaCl2以及K2HPO4质量浓度的增加，发酵液中伴胞晶体蛋白质量浓度都呈现出先增后减的趋势.而图4和图5以及图6响应面分析图曲面较平坦，说明在此浓度范围内，随着培养基浓度增加，发酵液中伴胞晶体蛋白浓度变化不大.同时，从图1到图6的等高线图可以看出，培养基4种组分中，K2HPO4与黄豆饼或玉米粉间交互作用显著，而K2HPO4与CaCl2之间不存在显著的交互作用.
2.4 最优培养基组分验证
以上回归模型预测结果表明，当培养基中黄豆饼、玉米粉、CaCl2与K2HPO4分别为25.73 g/L，12.57 g/L，0.25 g/L和0.43 g/L时，培养基达到最优，其发酵液产伴胞晶体蛋白最多，预测可达179.4 mg/L.为验证预测结果的可靠性，在培养基配方为黄豆饼25.73 g/L，玉米粉12.57 g/L，CaCl2 0.25 g/L，K2HPO4 0.43 g/L，ZnSO4 0.20 g/L，MgSO4 0.20 g/L，MnSO4 0.25 g/L和FeSO4 0.25 g/L时，进行摇瓶发酵重复实验，实验结果显示伴胞晶体蛋白为178.2 mg/L（175.6～179.2 mg/L）.与预测值179.4 mg/L较接近，能很好地拟合模型，说明该模型有效.利用优化后的培养基进行YC10菌株发酵培养，与优化前发酵液中伴胞晶体蛋白最高值137.6 mg/L相比，提高了29.5%.
3 结论和讨论
在微生物发酵中，培养基的优化常采用单因素法和正交实验法.单因素法只是针对某一因素的影响，没有考虑培养基中多种成分之间的交互作用，很难获得最佳优化结果，同时，该方法也较费时费力.正交实验虽然可以考虑因子中的交互作用，但实验次数多，同时不能明确得到一个组分中所有因子和响应值之间的函数表达式，因此难以确定整个组分中各因子的最佳组合 [10].响应面分析法是一种集统计、数学和计算机多学科的用于因子优化的综合性方法，常用于研究多因子系统中各因子交互作用达到最大响应值时所对应的最佳条件[11].Sumant等人利用响应面分析法对一株产碱性蛋白酶的芽胞杆菌发酵培养基进行优化，使其碱性蛋白酶产量提高了2.6倍[12].本研究通过PlackettBurman实验设计，快速有效地从8个能影响Bt产生伴胞晶体蛋白的因子中筛选出4个显著性影响因子.利用最陡爬坡实验法确定了4种重要影响因子的质量浓度范围，并结合响应面分析法快速确定了培养基最佳浓度组合：黄豆饼25.73 g/L，玉米粉12.57 g/L，CaCl2 0.25 g/L，K2HPO4 0.43 g/L，ZnSO4 0.20 g/L， MgSO4 0.20 g/L，MnSO4 0.25 g/L和FeSO4 025 g/L.在最佳培养基组合下，Bt菌株YC10伴胞晶体蛋白产量可达178.2 mg/L，比优化前提高了295%，与理论预测值接近，说明利用响应面分析法进行Bt菌株YC10发酵培养基的优化是合理可靠的.
有关Bt培养优化方面的研究已有不少文献报道，但基本都以发酵液中菌株生长浓度或孢子产量为评价指标[13～15]，进行发酵培养基或培养条件的筛选，而以Bt伴胞晶体蛋白产量为评价指标的相关报道很少.尽管Bt菌株发酵中芽胞的产生与晶体蛋白含量具有相关性，但是活芽胞数量却并不能反映出发酵液的毒力.Bt对害虫的毒杀作用取决于其产生的伴胞晶体毒素蛋白，伴胞晶体蛋白产量直接决定其杀虫效价.所以，利用发酵液中产生的伴胞晶体蛋白浓度作为培养基筛选优化的评价指标，能可靠地反映其毒力.伴胞晶体蛋白的产生直接受到培养基中碳源、氮源、盐离子等因素的影响，所以通过调整发酵培养基配方以提高Bt产生伴胞晶体蛋白的能力，对该菌株在农业生产上的应用具有重要意义.
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