评价，以期为平菇蛋白质含量指标的准确快速检测提供依据，为平菇种质资源评价筛选提供一种快速、简便、无损的分析方法。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
供试材料：平菇为山东省农业科学院农业资源与环境研究所菌种库保藏的70个菌株。平板培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g，加水至1 000 mL[3]。每个菌株接种3个平板，25℃避光培养9 d。
仪器设备：近红外光谱分析仪（杭州聚光科技SupNIR-2720 ）、紫外分光光度计（北京普析T6新世纪）、恒温培养箱（上海博讯）、生物样品研磨器（法国Bertin Precellys Evolution ）、烘箱（淄博新华医疗）、高速冷冻离心机（Eppendorf 5810 ）
1.2 检测方法
1.2.1 平板菌体蛋白质含量测定 采用标准曲线法。首先从5.00 mg/mL标准蛋白质溶液中用移液器分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用0.9% NaCl溶液分别稀释至10 mL，以0.9% NaCl溶液为参比，在280 nm处分别测定各标准溶液的吸光度，以标准溶液吸光度U为纵坐标、蛋白质含量（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线[4]（图1），可得标准溶液蛋白质含量标准曲线公式：y=0.6352x+0.0068，R2=0.9867 。
制备检测样品：每个菌株平板刮取500 mg菌丝放入加研磨珠的研磨管，液氮冷冻，放入生物样品研磨器5 000 r/min、5 min研磨2轮，再加入0.9%NaCl溶液1.0 mL，4℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液0.1 mL，用0.9% NaCl溶液稀释至10 mL，得到待测样品。将紫外分光光度计波长设为280 nm，检测样品吸光度，每样品做3份平行取平均值，代入标准曲线计算对应样品蛋白质浓度[5]。根据样品蛋白质浓度计算平板菌体蛋白质含量。
1.3 光谱数据采集
提前12 h将样品平板从恒温箱中取出，放入25℃烘箱除去样品的冷凝水。在光谱采集过程中保持25℃环境温度、35%环境湿度，使待测样品温度和湿度基本一致[6]。设置光谱扫描范围为1 000～1 799 nm，分辨率为10 nm，波长准确性为0.2 nm，波长重复性为±0.05 nm，吸光度噪声小于50 μA。将待测平板放在检测槽正中，面朝上并保证旋转扫描区域都在平板之内，样品旋转一周为5 s，重复扫描采集3次形成一条反射光谱储存。每个菌株采集3 个平板光谱信息，作为原始光谱，并将光谱信息转换成吸光度值储存[7]。
1.4 光谱预处理
将各样品含量数据与光谱数据一一对应并进行关联，使用RIMP化学计量学分析軟件进行光谱处理，采用k-s分类方法将样品集划分为校正集和验证集，采用80∶20的马氏距离分配[8]，将样品随机划分为168个校正集和42个验证集。
1.5 模型建立与评价方法
采用标准化、求导、平滑、信号校正等11 种预处理方法处理光谱。先用168个校正样品集在全光谱范围下应用偏最小二乘法（partia least squares method，PLS）建立校正模型，再将验正样品集进行外部验证，以校正标准差（SEC）、交互验证标准差（SECV）、预测标准差（SEP）、校正集相关系数（RC）和验证集相关系数（RP）、主因子数（MF）为参考标准，选出最优样品预处理方法[9]。根据一般模型评价的规则，在主因子数较少，SEP/SEC<1.2条件下，校正标准差、交互验证标准差、预测标准差越小且相互间越接近，说明近红外分析结果与化学分析结果越吻合，可信度越高；校正集相关系数和验证集相关系数越接近1，则模型预测值与化学分析值越接近，模型的准确度越高。以上述参数作为评价指标对模型进行优化时，应剔除个别异常值[10]。
2 结果与分析
2.1 化学分析结果
210个样品蛋白含量试验数据范围为 5.950%～14.510%，平均值为 10.000%，将其输入RIMP软件做参比值分析，参比值分布区见图2，经对比发现数据参比值变化幅度较大、分布范围比较宽，说明样品具有较好的代表性，建立的模型适用性较高[11]。
2.2 光谱数据预处理
经扫描获得210份平菇样品的近红外光谱图（图3）。从中可看出，光谱在1466 nm附近有最大吸收，该处位于蛋白质特征吸收谱段[122]。各样品的光谱波形很相似，但并不完全重合，这表明不同样本之间重现性良好，又存在差异。为了消除样品检测过程误差对建模的影响，需要对光谱进行预处理[13]。
2.2.1 校正集、验证集样品分析 由表1可见，校正集和验证集蛋白质含量数据的最大值、最小值及平均值与总样品数据接近，化学值分布的离散程度较高，表明校正集和验证集的分组合理，其数据相对于总样品具有代表性；验证集数据标准差、平均值与校正集偏差小，且上下限均包含在校正集数据内，因而验证集可用于对校正集所建模型的验证[14]。
2.2.2 光谱预处理方法的选择与最优模型构建 通过RIMP软件中的自动优化功能，对最佳光谱预处理方法进行筛选，最终确定在1 000～1 799 nm光谱范围内，Savitzky-Golay平滑+Savitzky-Golay导数+多元散射校正（MSC）+均值中心化为最优光谱预处理方法，采用PLS方法建立样品集分析预测模型，用验证集样品对模型进行验证，并依据相应参评指标的优劣筛选出最优光谱预处理方法，最优参评指标见表2。图4显示当主因子数为14的时候，得到的press值最小，但综合试验数据分析，主因子数为8时，模型能够包含样品集绝大多数光谱信息和蛋白含量信息，模型的预测偏差最小，因此模型最佳主因子数为8。
2.2.3 模型验证结果 用样品集建立的模型对验证集进行预测，其回归效果如图5所示。从中可以看出真实值与预测值分布在直线两侧，其相关系数为0.67263，说明预测效果比较好，化学法和近红外仪器法测定结果无显著差异，近红外测定结果准确可靠。
3 讨论与结论
近红外光谱作为一种间接性鉴定技术，能够无损、快速、准确给出成分复杂物质的特异图谱，作为定性和定量分析的依据[16，17]，该方法如果用于生产过程实时定量监测，将成为食用菌育种、生产自动化条件下质量控制的理想工具。
本研究以70个平菇菌株的210组数据为样本，采集样本在1 000～1 799 nm区域近红外光谱，以平板菌丝蛋白质含量为参考指标，通过化学分析方法得到与近红外光谱信息对应建模数据，分别输入软件，采用Savitzky-Golay平滑+Savitzky-Golay导数+多元散射校正（MSC）+均值中心化作为光谱预处理方法，应用偏最小二乘法（PLS）建立平菇蛋白质含量预测模型，经验证该模型真实值与预测值的相关系数为0.67263，预测结果符合有效范围，可用于平菇菌体蛋白质含量的快速无损检测。
后续试验中发现，在控制环境并严格操作流程的重复性试验条件下，大部分预测结果与实际试验数据偏差均在试验许可范围内，但建模样本数量、参考指标样本的分布广度、样品状态、水含量等都是影响模型准确度的重要因素，需要不断加入新的样品进行模型补充矫正，进一步提高模型的稳定性和准确性[15]。
参 考 文 献：
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