[摘要] 目的 观察异烟肼诱导致单耐异烟肼结核分枝杆菌假定药物外排泵基因表达情况，并探讨导致该基因高表达的原因。 方法 选取30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离株、20株全敏结核分支杆菌分离株和H37Rv（标准对照），对不同菌株进行无异烟肼与亚抑菌异烟肼的诱导培养，采用Real-time PCR技术检测27个假定外排泵基因表达量的变化，并且依据2-ΔΔCT进行计算假定药物外排泵基因的表达差异倍数。 结果 30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离基因均可能导致结核分枝杆菌对异烟肼的假定药物外排泵基因表达，且异烟肼会导致其外排泵基因的高表达。
[关键词] 异烟肼；结核分枝杆菌；外排泵基因；表达量
[中图分类号] R378 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（c）-0016-04
Preliminary study of isoniazid induced single INH resistant mycobacterium tuberculosis putative drug efflux pump gene expression variation
WANG Yan1 CHEN Lu2
1.Clinical Laboratory， Nanjing Thoracic Hospital， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Clinical Laboratory， Pukou District Center Hospital of Nanjing City， Jiangsu Province， Nanjing 211800， China
[Abstract] Objective To observe the expression of isoniazid induced to single resistance to isonicotinic acid hydrazide （INH） mycobacterium tuberculosis， and to discuss the possible cause of the high expression. Methods A total of 30 strains of single isoniazid resistant mycobacterium tuberculosis isolates， 20 strains of mycobacterium tuberculosis isolates and sensitivity of H37Rv （standard）， the different strains were cultured as hydrazine and sub inhibitory INH， and 27 putative efflux pump gene expression changes were detected by real-time PCR reverse transcription， and assuming multiple expression of drug efflux pump disease were calculated on the basis of 2-ΔΔCT. Results 30 strains of single INH resistant Mycobacterium tuberculosis isolates 18 strains of MIC was 2.0 μg/mL （14 strains katG 315 AGC-ACC mutations， 4 strains of non-mutant）， 8 strains of MIC was 1.0 μg/mL [4 strains katG 315 AGC-ACC mutations， 4 strains of inhA （-15） C-T mutation]， 4 strains of MIC was 4.0 μg/mL [3 strains of katG 315 AGC-ACC， 1 strain of ahpC （-88） G-A mutation]， 20 strains of Mycobacterium tuberculosis isolates sensitive without mutation. 27 putative drug discharge pump genes in the 11 genes showed high expression， mainly for Rv1258c， Rv2265， Rv0849， Rv0191， Rv1819c， Rv3239c， Rv2209， Rv2936， Rv2937， Rv1146， Rv2938c， and they were 5， 4， 4， 3， 3， 3， 2， 2， 2， 1， 1 strains/strain respectively. Conclusion In clinical， Rv1258c， Rv0849 and Rv2265 genes could lead to drugs on the assumption of ionized in mycobacterium tuberculosis efflux pump gene， and isoniazid can lead to high expression of discharge pump gene.
[Key words] Isoniazid； Mycobacterium tuberculosis； Efflux pump gene； Expression
结核病是临床中常见疾病之一，在该病的控制过程中依然面临着众多问题，常见的有耐药问题和人类免疫缺陷病毒与肺结核病毒的双重感染以及流动人口等[1]。资料显示，结核病患者耐药性可以达到39.0%以上。耐药结核疾病，特别是耐多药结核病成为了国家结核疾病控制规划的重大阻碍，也是导致当前疫情降低的最重要原因之一[2]。耐多药结核病多数是由于异烟肼与利福平两组或者多种药物的拮抗作用而导致的。结核分枝杆菌耐药主要是由于基因突变而导致药物的作用靶位失去和细菌细胞壁的通透性发生改变，从而使得药物不能有效地进入细胞内，并依赖主动外排系统将细菌胞内的药物排出[3-4]。其耐药机制主要是基因突变使得药物的作用靶位丧失，另外细菌细胞壁通透性发生改变使得药物不能够直接进入到细胞内，依赖主动外排系统将细菌胞内的药物排出。临床中依据药物外排机制的不同情况，外排泵可分为ATP水解能驱动型与跨膜质子梯度能驱动型两个类型，还可以分为5个不同的主要超家族体现为MFS、ABC、RND、AMR家族和MATE家族[5]。资料显示，结核分杆菌主要是通过药物外排泵对异烟肼药物做出应答反应，从而使其产生耐药[6]。因此，本研究中重点探讨异烟肼诱导致单耐异烟肼结核分枝杆菌假定药物外排泵基因表达量状况，并分析可能导致单耐异烟肼结核分枝杆菌假定药物外排泵基因高表达的具体原因，具体的分析如下：
1 材料与方法
1.1 材料
本次研究的菌株均是由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核室所提供，30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离株、20株全敏结核分枝杆菌分离株、H37Rv（标准对照）。
1.2 仪器与试剂
ADC营养添加剂与Middlebrook 7H9干粉（美国BD公司）、异烟肼药物干粉（美国Sigma公司）、Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、Alamar blue试剂（美国ABD Serotec公司）；除去DNA试剂盒（美国Invitrogen公司）、荧光定量PCR仪器（美国伯乐公司）、反转录试剂盒与荧光染料法Real-time PCR试剂（康为公司）。
1.3 基因组检测
基因组主要是采取十六烷基三甲溴化铵（CTAB）法进行检测，并且采取直接测序法进行检测异烟肼耐药的相关基因。同时，将PCR产物进行单向测序，并且采取生物信息学软件对其进行基因序列和H37Rv基因序列进行对比分析，基因型的检测采用Spoligotyping法进行辨别[7]。
1.4 最小抑菌浓度（MIC）检测
结核分枝杆菌异烟肼的MIC主要是采取微孔板Alamar blue显色法进行测定[8]。培养基中异烟肼的浓度为0.2 μg/mL，对于异烟肼MIC≤0.25 μg/mL的菌株，需要再次进行低浓度药物的梯度稀释，异烟肼需要按照0.0005～0.5 μg/mL的2倍系列稀释，蓝色完全没有发生改变为最小药物浓度。
1.5 假定药物外排泵基因检测
①依据N37Rv菌株全基因组序列进行管家基因secA1与27个假定药物外排泵基因的选择并设计引物。②细菌总RNA的制备，采取Trizol法进行提取总RNA，采取分光光度计进行测定总RNA的纯度与浓度状，以此进行质量测定。③去除DNA的污染，将提取的总RNA进行去污处理。经过上述的方法提取总RNA，体系为20.0 μL，主要包括100×DNaseⅠ
2 结果
2.1 基因突变观察
30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中18株MIC显示2.0 μg/mL（14株katG 315 AGC-ACC突变，4株无突变），8株MIC显示1.0 μg/mL[4株katG 315 AGC-ACC突变，4株inhA（-15）C-T突变]，4株MIC显示4.0 μg/mL[3株katG 315 AGC-ACC，1株ahpC（-88）G-A突变]，20株全敏结核分支杆菌分离株无突变。
2.2 假定药物外排泵基因观察
通过对标准株的27个假定药物外排泵基因的表达差异倍数观察，其差异倍数为0～1倍的10个，>1～2倍的12个，>2～3倍的5个，观察过程中并未见有差异倍数超过3倍。同时，20株全敏结核分支杆菌分离株中的27个假定药物外排泵基因的表达差异倍数观察，0～1倍的13个，>1～2倍的13个，>2～3倍的1个。每个基因表达量差异倍数为0～2倍，甚至达到80.0%以上。
27个假定药物外排泵基因中相对表达量差异倍数在部分菌株中天于4倍，一共有11个基因，主要体现为Rv1258c、Rv2265、Rv0849、Rv0191、Rv1819c、Rv3239c、Rv2209、Rv2936、Rv2937、Rv1146、Rv2938c。具体的株数见表2。
表2 30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中假定药物外排泵基因高表达分布
3 讨论
异烟肼是抗结核治疗中的常见药物，并且对结核杆菌具有较强的抑制与杀灭作用[10]。同时，其生物膜的穿透性相对比较好，且疗效佳、毒性小，在临床中被广泛应用。资料显示，异烟肼对结核分枝杆菌具有较高的选择性，且抗菌作用也是相对比较强。一般情况下，试管内0.025～0.05 mg/L的浓度可以更好地抑制病菌，且临床中较高浓度异烟肼（10.0 mg/L）对繁殖期的细菌具有较强的杀菌作用。同时，对于静止期结核杆菌，能够有效地提高药物的浓度，或者是更好地延长接触的时间，从而达到杀菌的作用，且对细胞内外结核杆菌也具有明显的作用。研究显示，异烟肼单独使用很容易产生药物的耐药性，而联合用药能够延缓药物的耐药性产生，最终增强其临床疗效。临床中虽有研究进一步对异烟肼的作用机制分析，但其具体的作用尚不明确[11]。主要分为两种情况，第一，异烟肼被转化为异烟酸，而异烟酸主要是作为烟酸的一种抗代谢物，并且代替烟酸结合在NAD+，最终使得受到抑制的NAD+不被催化；第二，主要是通过阻断去饱和酶而发挥作用，异烟肼能够有效抑制C24、C26饱和脂肪酸转化为C24、C26不饱和脂肪酸，而且这种不饱和脂肪酸很可能为霉菌酸前体，而霉菌酸也是细菌细胞壁的一种重要成分，该药物可以更好地抑制霉菌酸生物合成，最终使得细菌的耐酸性丧失。但是，临床中异烟肼暴露可能会引起结核分枝杆菌出现基因突变，且伴有药物外排泵的活性增加。一旦这种基因发生突变，很容易引起结核分枝杆菌分离株产生耐药，最终使得异烟肼治疗结核病作用降低[12]。研究显示，除基因突变导致异烟肼耐药之外，外排泵激活也可以导致异烟肼耐药的情况发生[13]。因此，本研究重点对30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离株和20株全敏结核分枝杆菌分离株进行异烟肼诱导，并且观察27个假定外排泵基因的表达状况，从而进一步了解其呈现高表达的具体原因。
通过本次的临床研究分析，临床中27个假定药物外排泵基因中有11个基因呈现高表达，且这些基因的表达状况均不相同。数据显示，基因主要体现为Rv1258c、Rv2265、Rv0849、Rv0191、Rv1819c、Rv3239c、Rv2209、Rv2936、Rv2937、Rv1146、Rv2938c。由此分析，单耐异烟肼结核分支杆菌株中存在假定药物外排泵基因高表达的情况，其具体可能是由于假定外排泵基因中的异烟肼被大量激活，从而使其呈现高表达[14-15]。同时，基因突变可能与药物外排泵的激活也具有相关性，且katG315位置的基因突变更相关[16]。本组的数据也显示，30株单耐异烟肼结核分枝杆菌分离株中18株MIC为2.0 μg/mL（14株katG 315 AGC-ACC突变，4株无突变），8株MIC为1.0 μg/mL[4株katG 315 AGC-ACC突变，4株inhA（-15）C-T突变]，4株MIC为4.0 μg/mL[3株katG 315 AGC-ACC，1株ahpC（-88）G-A突变]。进一步说明，katG315位置的基因突变在假定药物外排泵基因高表达中发挥着重要的作用。临床中相关研究显示，多耐药菌株可能是由于药物外排泵基因的作用，并不是由于基因突变所引起的[17]。但是也有相关的研究显示，外排泵基因可能起到促进其他耐药作用机制，从而导致异烟肼的耐药[18]。由于本次的临床研究显示，对于基因突变与外排泵之间的相关性依然需要临床中大量实验进一步研究，从而更准确地了解异烟肼耐药情况。但是，本研究观察例数较少，有待大样本进一步研究观察。
综上所述，临床中Rv1258c、Rv0849以及Rv2265等相关基因均可能导致结核分枝杆菌对异烟肼的假定药物外排泵基因的高表达。
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（收稿日期：2014-08-21 本文编辑：任 念）