【摘要】 Cre-loxp系统是近年来广泛应用在各领域的重组酶系统。该系统由组织特异性重组酶cre和loxp位点组成。可以通过对特定的DNA序列进行准确的切割及连接，达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的。牙釉质的发育离不开各种转录因子的作用，利用该系统对各转录因子的缺失或突变的研究，探讨特定时间、特定部位目的基因的异常改变对牙釉质发育的影响。
【关键词】 Cre-loxp系统； loxp位点； 重组酶cre； 转录因子
中图分类号 R78 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2016）11-0160-03
【Abstract】 Cre-loxp system is recombinant enzyme systems，widely used in various fields in recent years.The system consists of a tissue-specific recombinase cre and loxp site components.Through specific DNA sequences accurate cutting and connection，at the genetic level to achieve the purpose of orienting genetically engineered organisms.Enamel development is inseparable from the role of various transcription factors，utilization of the system for each missing or mutated transcription factors，investigate the effect of abnormal changes in a particular time parts of the gene of enamel development.
【Key words】 Cre-loxp system； Loxp site； Recombinase cre； Transcription factors
First-author’s address：Affiliated Hospital of Binzhou Medical，Binzhou 256600，China
doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.11.090
随着国民经济的日益发展，人们对口腔保健的意识也越来越强。口腔疾病的预防也越来越引起大家的注意，基因水平上对口腔致病微生物的研究越来越引起重视。龋病成为危害人类牙齿健康的首要因素。龋病的主要危害就是牙釉质的破坏。预防和保护牙釉质成为龋病预防的首要措施。由于鼠和人在基因组成上的相似性，小鼠模型越来越多的应用在基因研究上。
转基因小鼠的制备主要通过受精卵原核显微注射或胚胎干细胞打靶而获得。然而这两种方式获得的模型都有其局限性。受精卵原核显微注射获得的小鼠模型，由于某些基因表达产物使细胞或组织不能耐受，会出现胚胎致死性。基因敲除的小鼠，在全身的基因组中都会出现基因的缺失，常会影响其繁殖，无法对完成发育后期的基因功能进行分析。为了解决这一难题，人们力求获得一种方式可以定点插入基因、在特定组织表达，按照人们的意愿对目的基因进行调控。
特异性重组酶系统是在重组酶的催化作用下，两段DNA序列特定位点发生重组并连接[1]。位点特异性重组酶系统和传统的基因修饰技术的结合，克服了传统的转基因技术位点随机性和基因敲除的胚胎致死性。重组酶系统种类很多，包括来自埃希大肠杆菌噬菌体P1的cre/loxp和来自酿酒酵母2 μ的FLP/FRT系统结合酵母pSR系统等，而在这些系统中，研究最为深入、应用最为普遍的就是cre/loxp系统[2]。通过基因打靶将loxp位点瞄定在目的基因的两侧，利用cre重组酶可以特异性识别loxp位点，介导loxp位点间DNA片段重组的特性，设计组织特异性启动子启动cre基因在特定的组织特定的时间表达[3]，达到在特定部位特定时间敲除目的基因的目的。
1 Cre-loxp系统的作用机制
Cre-loxp系统由cre重组酶和loxp位点组成[4]。
1.1 cre重组酶
cre重组酶是由噬菌体P1中发现分子量为38 KD的蛋白质序列[5]，它是Int家族的一员。cre重组酶属于整合酶的一种，不仅具有催化活性，而且还具有和限制酶相似的活性，可以对特定的DNA序列进行剪切和切割。由于该重组酶是由单个的核苷酸序列组成，因此发挥作用时不需要借助外界因素的干预。
1.2 loxp位点
loxp位点可被cre重组酶特异性识别。loxp位点是一段长34 bp的DNA序列，由两个13 bp反向重复序列和一个8 bp不对称间隔区组成，该34 bp是cre重组酶发挥重组作用的必要条件[6]。
1.3 loxp位点与cre重组酶的作用方式
cre重组酶对于loxp位点的识别具有特异性，并引起两个loxp位点间的DNA序列发生特异性的重组；cre重组酶既可以识别不同方向的loxp位点，也可识别相同方向的loxp位点；cre重组酶可引起相同方向loxp位点间基因片段的缺失，切割两个同向的loxp位点间的序列，使两个同向的loxp位点合并为一个；对于不同方向的loxp位点，cre重组酶可引起其重组[7-9]。
2 动物模型的建立
Cre-loxp系统的建立是通过组织特异性表达cre重组酶的转基因鼠与loxp鼠杂交而建立的。
2.1 loxp鼠模型的构建
loxp鼠的构建主要是通过基因打靶的原理，将loxp位点插入到目的基因两侧的内含子中，该插入基因的存在不会引起原基因序列表达的改变。为了提高筛选效率，同时插入阳性标记neo基因和作为负性筛选的DTA，将构建成功的载体，通过电转的方式转入ES细胞，通过对中靶的ES细胞进行筛选和鉴定，得到同源重组正确的阳性克隆。通过显微注射的方式，将中靶的阳性细胞导入囊胚，将囊胚移植到代孕母鼠的子宫内，小鼠出生后经PCR筛选鉴定即可得到嵌合体flox小鼠。将此嵌合体flox小鼠和FLP工具鼠杂交后去掉阳性标记的neo基因即可得到被loxp位点瞄定的flox小鼠。
2.2 cre鼠模型的构建
cre酶是一种外源性的重组酶，单纯在生物体内不存在。为了启动cre重组酶在生物体内的表达，需要设计特异性启动子启动其在生物体内的表达，可以选择特定部位、特定时间表达的基因作为启动子，这样就达到了研究特定基因在特定的时间、特定部位表达的目的。例如，为了研究某些基因的缺失或突变对牙釉质发育的影响，首先应该设计特异性启动子启动cre重组酶的表达。参与牙釉质形成过程中的一些釉原蛋白基因均可启动其特异性表达。将特异性启动子和cre重组酶构建成的载体单酶切线性化后通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后溶解于显微DNA缓冲液中，将线性化后的DNA通过原核注射的方式注射到受精卵内，显微注射后的受精卵送回代孕母鼠的子宫内，小鼠出生后经PCR鉴别筛选，即可得到阳性的组织特异性表达的cre鼠[10]。
3 cre鼠的筛选
由于Cre-loxp重组酶系统能否将目的基因有效的敲除依赖于cre重组酶的活性[11]，因此，为了保证目的基因的有效敲除，首先必须保证cre鼠体内cre重组酶表达的高效性。cre鼠是通过转基因获得，由于转基因技术的局限性，cre基因插入的位点不唯一，因此，对于每一种胚胎注射来源的cre鼠需要分别建系，即将F0代cre鼠分别和WT小鼠杂交，然后再利用后代同窝阳性小鼠自交来分别繁殖。当每一个系繁殖至F1代后，可取F0代新生小鼠的特异性组织进行western检测外源性cre重组酶在特定组织的表达情况。也可提取特异性组织部位的RNA，反转录后定性的观察cre重组酶是否有表达，从中初步筛选出cre高表达的转基因cre鼠。仅在基因水平上的检测不能确定cre重组酶对目的基因切割的效率。为此，引进一种ROSA26小鼠和R26GRR小鼠。ROSA26小鼠lacz基因前有一个强的终止子序列，终止子序列两端被两个loxp序列铆定[12]。将ROSA26小鼠和表达cre重组酶的转基因小鼠交配，得到双转基因小鼠。cre重组酶能将两个loxp序列间的终止子删除，lacz基因得以表达。β-半乳糖苷酶是lacz基因的特异性产物，lacz基因表达时，其产生的β-半乳糖苷酶遇到作用底物x-gal时，表达酶的组织会出现蓝色，因此，通过lacz染色可以反映cre重组酶表达的部位特异性[13]。为了更加证实cre在特定组织表达的活性，可以用另外一种R26GRR小鼠，这种小鼠是以C57BL/6N小鼠为背景，在其体内插入ROSA26基因和cre报告基因，当R26GRR在和cre鼠杂交之前染色显示绿色荧光，当与cre鼠杂交以后呈现强红色荧光[14]。
4 基因敲除小鼠模型的获得
利用组织特异性表达的cre鼠和基因打靶获得的loxp鼠杂交，根据孟德尔遗传定律，筛选出后代中双转基因表达的小鼠，此种小鼠同窝杂交或/和loxp纯合子小鼠杂交，获得的loxp转基因纯合子、cre阳性的小鼠即为所需的条件性完全敲除的小鼠模型。利用该小鼠模型可对特定部位、特定时间表达的目的基因进行分析，研究其对生物体性状的影响。
5 Cre-loxp系统在牙釉质发育中的应用
近年来，cre-loxp系统在牙釉质发育中的研究报道与日俱增。例如，文献[15]表明，由于牙釉质形成于小鼠出生以后，而Racl缺失小鼠胚胎时就已死亡。Rac1缺失的小鼠在胚胎时期表现出成纤维细胞形态的缺陷，板状伪足的形成[16]。被人角质素-14启动子启动的Rac1小鼠表现明显的皮肤和口腔伤口愈合的延迟[17]。但是关于Rac1在牙釉质形成中的作用没有明确的研究。为此，Huang等[18]利用cre/loxp系统，将cre置于人角质素-14启动子的控制下，用loxp锚定Rac1，并将loxp锚定的Rac1小鼠和人角质素-14-cre鼠交配，构建出了牙釉质特异性敲除Rac1的小鼠模型。该小鼠只在成釉细胞中敲除了Rac1，克服了Rac1缺失的胚胎致死性，使在活体内研究Rac1缺失对小鼠牙釉质发育的影响成为可能。在体外研究牙釉质的形成中发现，CCAAT/增强子-结合蛋白（C/EBP）-α对牙釉质发育基因的表达有调控作用，而组成性C/EBP-α缺失的小鼠在出生时已死亡。Xu等[19]利用cre/loxp系统，将cre基因置于人角质素-14启动子的控制下，用loxp位点锚定C/EBP-α，将被loxp锚定的C/EBP-α小鼠和人角质素-14-cre鼠交配，构建出了C/EBP-α条件性敲除的小鼠模型。该小鼠也仅在成釉细胞敲除了C/EBP-α，克服了C/EBP-α缺失的胚胎致死性，使在活体内研究C/EBP-α对于牙釉质发育的影响得以实现。
6 Cre-loxp系统应用的意义
传统的转基因动物模型的是通过原核显微注射的方式获得，原核显微注射技术插入的位点具有随机性，不能保证位点一致性，位点的不一致就会对后续动物模型的筛选有很大的影响，也会增加筛选的时间。Cre-loxp系统与基因打靶技术相结合，组成条件性基因打靶，可克服传统技术的局限性，利用同源重组的方式，将打靶基因置于相同方向的loxp位点间的打靶载体上，经过在ES细胞上的同源重组和筛选，得到携带载体的flox/flox小鼠，此小鼠和受控于组织特异性启动子的cre鼠杂交，在cre重组酶的介导下，得到靶基因在特点时间特定组织敲除的条件性敲除小鼠动物模型。Cre-loxp系统的应用，使其对生物体内和生物体外的遗传操作得以实现，它与基因打靶技术的联合应用，使靶基因的缺失或突变仅发生在小鼠特定的组织或特定的时间。这就使得精确分析基因在特定部位作用的愿望得以实现。
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（收稿日期：2015-12-21） （编辑：何玉勤）