摘要：[目的]筛选出可适于配合型生物饲料高温加工需要的酵母菌株。[方法]通过对国家允许使用的酵母菌6株进行高温损伤耐受性试验和高活性培养条件的研究。[结果]筛选到可耐受45 ℃高温并保持108个/ml的高活菌数的菌株2株DQFC2117-1和DQFC2122-2。[结论]筛选出的菌株DQFC2117-1和DQFC2122-2可作为配合型生物饲料加工所需要的耐高温酵母菌株。
关键词：耐高温;饲用酵母;配合型;生物饲料
中图分类号 S816.6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）02-086-02
Screening of High Temperature Resistant Forage Yeast Strains
LIU Yu-feng， WANG Yue-ming， YANG Qing-li et al
（Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences， Daqing， Heilongjiang 163319）
Abstract [Objective] To filter out yeast strains adapt to fit the need of biological feed with high temperature processing. [Method] By using yeast to the state allows the use of 6 lines to study condition and high temperature damage tolerance culture experiment in high activity. [Result] DQFC2117-1 and DQFC2122-2 obtained can withstand high temperature of 45 ℃ and the high number of live cells108 cfu/ml strains. [Conclusion] The screened strains DQFC2117-1 and DQFC2122-2 can be used as strain yeast for biological feed processing.
Key words High temperature resistance; Feed yeast; Fit type; Biological feed
基金项目 黑龙江省财政厅基本应用技术研究专项。
作者简介
刘宇峰（1963-），女，辽宁丹东人，研究员，从事微生物饲料研究。
收稿日期 2014-11-19
我国目前企业生产的酵母生产工艺从初期的吸附法的压榨酵母（含水量20%）到20世纪80年代的气流干燥普通活性干酵母（含水量8%），至目前的快速低温干燥技术的速效活性干酵母（含水量4%～5%），均属于真空包装的活性干酵母类型[1]。因此，尚无法突破饲料行业在生物饲料的配合型终端生物饲料产品的粗放性的加工、造粒所遭受的机械损伤及粗放保存、长途运输和粗放使用而导致的活力损伤的技术瓶颈，这些产品往往在加工过程中其生物活性就几乎全部损失[2]，因此在很大程度上限制了活性酵母在生物饲料领域的应用和拓展。因此，可耐受粗放条件的饲用活性酵母产品的技术研发问题就被客观地突显出来。笔者选育出高活性和耐高温的饲用酵母菌种，以期为今后研究高活性、耐高温、耐造粒、耐贮运的直投式饲用酵母添加剂新产品奠定重要的菌种基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
菌种。饲用酵母菌DJ-1，分离自大连兴和饲用活性干酵母产品;产朊假丝酵母，由黑龙江省科学院微生物所惠赠;
酿酒酵母，由东北农业大学食品学院惠赠;
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AS2.300 FFCC2117和FFCC2167、
产朊假丝酵母Candida utilis，AS2.1028 FFCC2122，均由大连工业大学惠赠。
1.1.2
培养基。马铃薯培养基、察氏培养基、麦芽汁培养基、豆芽汁培养基;其他化学试剂均为国产化学纯。马铃薯和大豆均采用东北优质材料。
1.2 仪器
数显电热培养箱，型号HPX—9082MBE，为上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品;
振荡培养箱，型号HZQ—X100，为哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品;
生物安全柜，型号BSC-1360ⅡA2，为北京东联哈尔仪器制造有限公司产品;
立式自动电热压力蒸汽灭菌器，为型号LDZX—40SCI，为上海申安医疗仪器厂产品;
生物显微镜，型号BK-5000，为重庆奥特光学仪器有限公司产品;
紫外可见分光光度计，型号UV-759，为上海精密科学仪器有限公司产品;
酸度计，为上海精密科学仪器有限公司产品。
1.3 试验方法
1.3.1
纯化与分离。将已收集的6株饲用酵母采用麦芽汁琼脂平板法28 ℃下培养24 h，进行菌种纯化。对具有酵母典型性形态的单菌落进行观察;以无菌水洗下斜面培育的酿酒酵母菌苔，制成菌悬液， 取0.05%美蓝染色液1滴，置于载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色2～3 min，加上盖玻片，置于高倍镜下观察酵母菌个体形态，进行显微镜检定。最后，将具有典型性的单菌落划线至麦芽汁固体斜面培养基上保存备用[3]。
1.3.2
适宜培养基的初步筛选。将已纯化分离出的6株饲用酵母斜面菌分别接种于马铃薯培养基、察氏培养基、麦芽汁培养基和豆芽汁培养基4种酵母常用的液体培养基上，28 ℃下培养24 h，以平板计数法检测酵母的活菌数为指标，确定各菌株适宜的培养基。
1.3.3
耐高温酵母菌株的菌种诱变及筛选。将培养好的6株酵母斜面作为出发菌株，进行Co60放射物理诱变，照射剂量为3 000 Gy。将诱变后的斜面菌全部洗脱至各菌株适宜的液体培养基中，以出发菌株为对照，分别于40、45和50 ℃震荡培养24 h，采用平板法筛选出生长较旺盛的酵母菌株，划入各菌株适宜的斜面培养基， 4 ℃下保存。
2 结果与分析
2.1 饲用酵母菌种的分离与纯化
通过对6株饲用酵母在麦芽汁琼脂平板法上的单菌落形态的观察和显微镜检定，分离出菌落饱满、生长快且具有酵母典型性形态的菌株各2株。
从表1可以看出，所收集的6株菌株菌符合酵母菌的典型特性，并经纯化后获得了12株酵母纯菌株。
表1 分离纯化出的饲用酵母菌株的菌落特征
2.2 适宜的酵母培养基筛选
将6株酵母分别纯化出的菌株6株按1%接种量分别接种于100 ml马铃薯培养基、察氏培养基、麦芽汁培养基和豆芽汁培养基4种酵母常用液体培养基中，28 ℃ 震荡培养24 h 后，分别采用平板活菌数计数法测定酵母菌的生成量，以确定培养基的适宜情况。
从表2可以看出，饲用酵母DQDJ-1较适宜的培养基为马铃薯培养基和麦芽汁培养基;产朊假丝酵母DQCR-1 较适宜的培养基为马铃薯培养基和察氏培养基;酿酒酵母DQDN-2 适宜的培养基是麦芽汁培养基;产朊假丝酵母DQFC2122-1和酿酒酵母DQFC2117-1适宜的培养基都是马铃薯培养基; 酿酒酵母DQFC2167-1适宜的培养基为马铃薯培养基和麦芽汁培养基。
表2 6株酵母在不同液体培养基中的活菌数
CFU/ml
注：**表示差异极显著（P<0.01）;*表示差异显著（P<0.05）。
2.3 耐高温酵母菌株的菌种诱变及筛选
将经过剂量3 000 Gy的Co60放射物理诱变的6株酵母，以出发菌株为对照，分别经40、45、50 ℃培养24 h的高温条件筛选后，采用平板法测定存活的菌数，并经诱变前后方差分析后，筛选出可以显著耐受高温的酵母菌株。
从表3可以看出，经过诱变后DQFC2117-1和DQFC2122-1菌株在马铃薯培养基上存活的菌落数与出发对照株相比有显著性提高，可以耐受45 ℃的培养温度。2株菌株光学及电子显微镜下的细胞形态见图1～4。
3 结论与讨论
该研究以具有提高含脂量和生香味的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AS2.300 FFCC2117和可提高蛋白含量的食用及饲料酵母-产朊假丝酵母Candida utilis AS2.1028 FFCC2122为出发点菌株，通过诱变和筛选，得到2株可耐受45 ℃的高培养温度的菌株DQFC2117-1、DQFC2122-1，突破了以前作为饲料工业允许使用的酿酒酵母和产朊假丝酵母的25～28 ℃液体培养的经典培养模式，为今后进一步研究耐高温、耐造粒、耐贮运的高活性直投式饲用酵母添加剂新产品奠定了重要的耐高温菌种的研究基础。
图1 光学显微镜下耐高温产朊假丝酵母DQFC2122-1菌株的细胞形态
图2 光学显微镜下耐高温酿酒酵母DQFC2117-1菌株的细胞形态
图3 电子显微镜下耐高温产朊假丝酵母DQFC2122-1菌株的细胞形态
图4 电子显微镜下耐高温酿酒酵母DQFC2117-1菌株的细胞形态
微生物广泛存在于自然界，至今已发现大量极端微生物，如极端嗜盐菌和极端嗜酸、嗜热的菌[4]。嗜热微生物（Thermophiles）是一种能在高于40～50 ℃温度下生长 ，最适生长温度为55～65 ℃，最高生长温度80 ℃的微生物。发酵工业中应用的德氏乳酸杆菌的最适生长温度为45～50 ℃，嗜热糖化芽孢杆菌为65 ℃。关于嗜热微生物能在高温环境中生存的原因，有人认为是胞内酶和蛋白质分子中1个或多个部位被某些氨基酸所取代，能以特殊的方式折叠，导致抵抗温度的变性作用胞内酶和蛋白质在高温时更稳定。另外，细胞质膜富含饱和脂肪酸，因而膜在高温下仍很稳定并发挥功能。tRNA在特定的碱基区域含较多GC对，使其核酸有热稳定性的结构。但是，以前研究的嗜热微生物大部分为细菌，常见于温泉、热泉、火山喷气口、海底火山喷气口、堆肥，在食品发酵工业应用中较为少见。2011年徐大鹏等[5]在乙醇发酵的菌中筛选到1株可在41 ℃下良好生长的耐高温产酒精酵母菌，证实了耐高温酵母菌的真实存在，也为该研究提供了耐高温饲用酵母菌筛选成功的有力佐证。该研究可为今后耐高温酵母菌在生物饲料及其他应用领域的广泛应用提供理论依据。
参考文献
[1] 张建峰，耿宏伟，王丕武.酿酒活性干酵母生产工艺优化及干燥剂的选择[J].食品科学，2011（9）：213-216.
[2] 胡彬.活性干酵母行业发展瓶颈与对策[J].中国食品工业，2006（7）：20-21.
[3] 于景芝.酵母生产与应用手册[M].北京：中国轻工业出版社，2005：20-400.
[4] 沈萍.微生物学[M].北京：高等教育出版社，2000：1-30.
[5] 徐大鹏，李云杰，张栩，等.耐高温酵母菌的筛选及特性[J].生物加工过程，2011（3）：17-21.