摘要：以点带石斑鱼（W池）、大菱鲆（D池）、红鳍东方鲀（H池）及半滑舌鳎（B池）4个鱼种循环水养殖系统净化池中采集水样为对象，采用平板分离法及液体培养法定量研究具有除磷能力的细菌及其特性。结果表明，4个系统中共培养16株除磷细菌；其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌具有较强的除磷能力和效果（皮特不动杆菌>创伤弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌）；总除磷能力与细菌总浓度呈正相关；4种细菌去除NH4+-N效果为哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不动杆菌>创伤弧菌；其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌具有除TN能力，去除TN的效果为皮特不动杆菌>哈夫尼希瓦氏菌=创伤弧菌。
关键词：循环水养殖系统；细菌；除磷；氨氮；总氮
中图分类号： S967.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0120-04
通信作者：陈成勋，研究员，主要从事水产动物增养殖学研究。E-mail：489699261@qq.com。随着海水集约化养殖模式的发展，饵料投放、养殖密度的提高使水体中营养盐污染问题突出，为循环水系统磷处理压力不断增加。目前，循环水系统中除磷工艺主要靠的是微生物的解磷作用。高效的解磷菌可以有效地缓解集约化循化水系统中的除磷压力。因此，筛选高效的除磷细菌成为了目前学者们的主要研究热点。微生物分解环节严重受阻，成为水体系统循环过程的制约条件，造成水体富营养化甚至污染，引发出诸多病害、药残、食品隐患等问题。当前，对养殖水体除磷方式的研究包括物理法、化学法、植物法（藻类、水草）、微生物学方法[1-6]，其中对不同养殖种类的集约化循环水养殖系统中除磷细菌的种类及多样性特征的报道较少。本研究以点带石斑鱼、大菱鲆、红鳍东方鲀和半滑舌鳎4种集约化养殖种类的同种循环水养殖系统作为研究对象，通过分离培养、筛选比较的方式进行除磷菌研究，从而寻找循环水养殖系统中除磷能力较高的除磷菌，了解其多样性特征，为集约化养殖循环水养殖系统的发展提供参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
以天津市海发珍品实业发展有限公司循环水养殖系统净化池为研究对象，对其中可培养性细菌进行分离提纯。
普通可培养性细菌通用培养基：琼脂15 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、蒸馏水100 mL，121 ℃高温灭菌15 min。
无机磷液体培养基[7]：NH4Cl 0.50 g、柠檬酸钠5.66 g、维氏盐溶液50 mL、蒸馏水100 mL，pH值7.0。
维氏盐溶液：K2HPO4 5.00 g、MgSO4·7H2O 2.50 g、FeSO2·7H2O 0.05 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、盐度为1.5%的卤水。
1.2主要仪器设备
振荡培养箱（BS-1E型，环宇科学仪器厂）；灭菌锅（TOMY SX500型，上海麦森医疗科技有限公司）；超净工作台（SW-CJ-2FD型，苏净安泰）；冷冻离心机（LEGEND MACH 1.6R型，Thermo）；紫外分光光度计（UVmini-1240型，东莞市塘厦众和电子仪器设备商行）；光学显微镜（Leica DM500型，德国莱卡）。
1.3方法将采集到的样本按10-3、10-4、10-5的浓度稀释，并取一定量的稀释液在普通用可培养性细菌培养基上涂布，24 ℃培养16～18 h。通过低倍显微镜观察菌落外形（例如：菌落形状、菌落颜色、边缘是否光滑、边缘线形状、内部纹理形状等）将菌落进行分类并标号，统计每1种细菌菌落的数目，推算出浓度。将区分开的菌落通过平板划线法进行充分分离纯化（3～4次），要求每一次都由单菌落进行划线。将分离纯化后的细菌通过16S rRNA进行测序。
利用无机磷液体培养基培养分离出的细菌24 h，测定无机磷含量变化同时测定氨氮与总氮的含量变化，计算其相关性。
1.4統计分析
所得数据在SPSS 19.0及Excel统计软件上进行处理。结果显示，细菌浓度、除磷能力、除氨氮能力和除总氮能力4个因素间没有显著相关性。而各循环水养殖池细菌总浓度与总除磷能力呈正比（r2=0.999）。
2结果与分析
2.1细菌种类鉴定与系统发育树分析
DNA分子的制备与分子发育树的制作参照文献[8]进行。
16S rRNA测序的通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。进行PCR扩增，将PCR产物送至测序公司（北京金唯智生物股份有限公司）进行纯化和测序。测序获得的16S rRNA基因序列长度为890～1 500 bp，测序结果在NCBI进行Blast分析。序列对比采用Clustalx的多序列比对排列，系统发育树采用Mega 5.05的邻接法。
经普通培养基平板24 ℃培养18～24 h，根据菌落的形态学特征（菌落形状、颜色、边缘是否光滑、菌落表面是否光滑、菌落纹路形状等特点）从点带石斑鱼（W池）、半滑舌鳎（B池）、红鳍东方鲀（H池）、大菱鲆（D池）4个循环水养殖系统中分离并获得16S rRNA基因有效序列的细菌16株。利用Blast检索获得的16S rRNA基因序列相似性最高的模式菌株，结果发现所有检测序列均与GenBank中已有的模式菌株16S rRNA基因序列相似性达98.0%以上，为已知菌种，其中相似度在99.0%以上的占 81.3%。分子鉴定与系统发育分析表明，分离到的可培养细菌分别属于变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）2个门，其中仅农研所芽孢杆菌（Bacillus niabensis）属于厚壁菌门，其余15株细菌均属于变形菌门γ-变形菌纲，分别属于弧菌目（Vibrionales）、假单胞菌目（Pseudomonadales）、交替单胞菌目（Alteromonadales）、肠杆菌目（Enterobacteriales）4个目菌株数分别为7、5、2、1株，分别占43.8%、32.3%、12.5%、6.3%（图1）。
2.2可培养性细菌浓度比较
通过平板计数法可知，养殖点带石斑鱼的循环水养殖系统中净化池中的细菌浓度是最大的，养殖大菱鲆的循环水养殖系统净化池中的细菌浓度其次，细菌浓度最小的是养殖半滑舌鳎的循环水养殖系统净化池。浓度最高的细菌为Vibrio ponticus，该细菌与浓度排名第二的约氏不动杆菌存在于养殖点带石斑鱼的循环水养殖系统净化池中。其中，约氏不动杆菌同时存在于石斑鱼和大菱鲆2种循环水养殖系统中。细菌浓度较小的是养殖大菱鲆的循环水养殖系统净化池和养殖红鳍东方鲀的循环水养殖系统净化池，同时，它们也是含有可培养性细菌种类最多的净化池，均含有5种可培养细菌。在养殖点带石斑鱼的循环水养殖系统净化池中分离出4株可培养性细菌，分别是Vibrio ponticus、约氏不动杆菌、农研所芽孢杆菌、皮特不动杆菌，分离出可培养性细菌最少的净化池是养殖半滑舌鳎的循环水养殖系统，仅分离出哈维氏菌和副溶血弧菌2种细菌。浓度最低的可培养性细菌是存在于养殖点带石斑鱼的循环水养殖系统净化池中的皮特不动杆菌（表1）。
2.3各细菌除磷、氨氮以及总氮性能比较
试验表明，在W池、D池、H池、B池中均有除磷能力较强的菌，分别是皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、創伤弧菌、副溶血弧菌，除磷能力分别为44.00%、22.00%、22.30%、2040%，除磷效果为皮特不动杆菌>创伤弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌。循环水养殖系统净化池中各菌株浓度与其除磷、除氮能力显著相关；净化池中细菌总浓度与总除磷能力显著相关。除磷能力强的菌株对除NH4+-N有较强能力，去除NH4+-N能力分别为57.90%、73.90%、33.40%、73.80%；去除NH4+-N效果为：哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不动杆菌>创伤弧菌；其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌具有去除TN的能力，去除率分别为5920%、19.10%、19.10%；去除TN的效果为皮特不动杆菌>哈夫尼希瓦氏菌=创伤弧菌。约氏不动杆菌同时存在于点带石斑鱼和大菱鲆养殖系统中，但是其除磷和去除 NH4+-N及TN的能力均有显著差异（表1）。
3讨论
本研究分离出16株细菌，分别为4株不动杆菌属（Acinetobacter）、7株弧菌属（Vibrio）、1株假单胞菌属（Pseudomonas）、2株希瓦氏菌属（Shewanella）、1株克吕沃尔菌属（Kluyvera）、1株芽孢杆菌属（Bacillus），目前发现的聚磷菌有圆褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、硝化杆菌属、亚硝化杆菌属、单胞菌属、假单胞菌属、节细菌属、棒状杆菌属、有色杆菌属、微球杆菌属、分支杆菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属等[9-13]。
测试结果表明，在生物滤池内的所有细菌中，浓度最大的细菌并不是除磷、除氮能力最好的细菌，Shewanella seohaensis在养殖大菱鲆的循环水养殖系统中占51.50%，但其实际除磷、除氮能力只有19.00%、0.00%。Wagne等发现不动杆菌属具有较好的除磷能力，但是对EBPR活性污泥中的不动杆菌属进行定量分析，发现其数量少于活性污泥微生物种群总量的10%[14-16]。有研究发现，在循环水养殖系统中点带石斑鱼养殖密度高对饲料的需求量较大，对水体洁净度要求较低，水体中氮、磷含量较高[17-19]，Chrzanowski等发现氮、磷可促进细菌生长，增加细菌的种群密度和均匀度，但优势种群丰度会降低[20-21]。本试验结果表明，点带石斑鱼养殖系统中细菌的浓度是4种养殖池中最大的，且可培养性细菌种类较多，系统中细菌种类及密度跟所养殖的鱼种类密切相关。
微生物的群落结构与多样性主要受外界环境影响。养殖环境中的微生物不仅受水体中的饵料、排泄物、温度、光照等因素影响，而且有研究表明其与肠道微生物有着密切的联系。Leamaster等研究发现养殖水盐度会影响鱼肠道菌群落结构[22-25]，同时张皓等发现在同种养殖环境中鱼的种类不同会导致肠道微生物群落结构不同[26]，凌泽春等发现，养殖鱼类肠道微生物菌群与水体中菌群有一定的关系[27]，本研究发现4种鱼类的养殖环境均相同（循环水系统、水源、饲料、温度、光照等），而细菌群落结构与多样性明显不同，有可能是受养殖产品的影响，说明养殖鱼类对水体中细菌群落结构有一定的影响作用。进一步证明了养殖鱼种与养殖水体中群落存在着相互作用关系。
在石斑鱼循环水系统中提取出的皮特不动杆菌，经分离培养鉴定为1株聚磷细菌，除磷能力高于其他3株细菌，除磷率达到44.00%，是1株高效除磷细菌。在养殖环境中，可以通过溶磷作用将环境中的不溶或难溶性磷（磷酸三钙等）转化为可溶性磷[28]，并通过聚磷作用将无机磷转化为有机磷，从而为养殖环境中浮游动植物提供营养物质，优化养殖环境。
本试验样本来自循环水养殖系统中的净化池，水中含有较高的磷元素，通过细菌分离、纯化得到了16株可培养性细菌，经过液体定量培养基对细菌的除磷能力研究，结果显示循环水养殖系统净化池中可培养菌均有一定的除磷能力。试验表明，在W池、D池、H池、B池中均有除磷能力较高的菌，分别是皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌，除磷率分别为44.00%、22.00%、22.30%、20.40%。
经测定半滑舌鳎和大菱鲆的养殖系统中可培养细菌的浓度及总除磷能力均相近。半滑舌鳎和大菱鲆均属于鲆鲽类，其食性及生存方式相近，故在同等密度饲养及等量投喂饵料时，水体中无机盐成分和浓度相似，其细菌浓度和总除磷除氮能力也相近[29-30]。试验结果表明，除磷性能好的菌株对氨氮和总氮有较好的清除能力，细菌的除磷和除氮可能是同时进行的。关于除磷脱氮之间的相互作用还有待于进一步探究。
4结论
（1）循环水养殖系统净化池中的细菌总浓度：点带石斑鱼>大菱鲆>红鳍东方鲀>半滑舌鳎，这可能跟不同鱼类的消化吸收能力不同有关。共分离出16株可培养细菌。
（2）试验表明在B池、D池、H池、W池中均有除磷能力较强的菌，分别是皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌，除磷效果为皮特不动杆菌>创伤弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌。
（3）发现4株除磷能力强的菌株对除NH4+-N也有较强能力，去除NH4+-N效果为哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不动杆菌>创伤弧菌；同时具有较好的除TN能力，个别细菌（副溶血弧菌）除外，去除TN的效果为皮特不动杆菌>哈夫尼希瓦氏菌=创伤弧菌。
（4）发现皮特不动杆菌不仅具有反硝化功能及溶磷功能，在本研究中发现还是1株高效除磷细菌。
（5）养殖产品对养殖环境中的微生物有一定的影响作用，该研究结果为集约化工厂化养殖水体的治理提供了有效的菌种资源信息，同时为反硝化除磷技术的应用推广提供了理论依据。
参考文献：
[1]刘宁，陈小光，崔彦召，等. 化学除磷工艺研究进展[J]. 化工进展，2012，31（7）：1597-1603.
[2]肖文涛. 污水生物脱氮除磷工艺的现状与发展[J]. 环境保护与循环经济，2010，30（11）：59-62.
[3]蒋轶锋. 短程反硝化除磷工艺特征及运行效能研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，2006.
[4]刘洪波，李卓，缪强强，等. 传统生物除磷脱氮工艺和反硝化除磷工艺对比[J]. 工业用水与废水，2006，37（6）：4-7.
[5]田淑媛，杨睿，顾平，等. 生物除磷工艺技术发展[J]. 城市环境与城市生态，2000（4）：45-47.
[6]孙朦朦. 两株海水异养硝化-好氧反硝化菌的分离、鉴定、培养、硝化性能及脱氮性能研究[D]. 天津：天津农学院，2014.
[7]葛辉. 异养硝化与好氧反硝化细菌的筛选、培养及综合除氮研究[D]. 苏州：苏州科技学院，2011：21-22.
[8]林学政，陈靠山，何培青，等. 种植盐地碱蓬改良滨海盐渍土对土壤微生物区系的影响[J]. 生态学报，2006，26（3）：801-807.
[9]东野脉兴，樊竹青，张灼，等. 云南滇池微生物对磷循环与沉积作用的实验研究[J]. 化工矿产地质，2003，25（2）：65-75.
[10]李翠. 官厅水库沉积物中解磷细菌的垂直分布特征及其对磷循环的作用[D]. 北京：中国农业大学，2005.
[11]李阜棣，胡正嘉. 微生物学[M]. 5版. 北京：中国农业出版社，2000：228.
[12]陈华癸撰. 土壤微生物学[M]. 北京：商务印书馆，1950：225-228.
[13]赵小蓉，林启美. 微生物解磷的研究进展[J]. 土壤肥料，2001（3）：7-11.
[14]Sundara R B，Sinha M K. Phosphate dissolving microorganisms in the rhizosphere and soil[J]. India J Agric Sci，1963，33（4）：272-278.
[15]Groudieva T，Kambourova M，Yusef H，et al. Diversity and cold-active hydrolytic enzymes of culturable bacteria associated with Arctic sea ice，Spitzbergen[J]. Extremophiles，2004，8（6）：475-488.
[16]王亚东，王少坡，郑莎莎，等. 生物除磷系统的聚磷微生物种群及其检测方法[J]. 环境工程，2015，33（2）：21-26.
[17]陈晓燕，胡超群，陈偿，等. 人工养殖点带石斑鱼弧菌病病原菌的分离及鉴定[J]. 海洋科学，2003，27（6）：68-72.
[18]杨俊江，董晓慧，谭北平，等. 石斑鱼营养需要与饲料利用研究进展[J]. 中国饲料，2012（10）：34-39.
[19]陈义明. 大菱鲆幼鱼生长、代谢及循环水养殖系统研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2013.
[20]Chrzanowski T H，Sterner R W，Elser J J. Nutrient eichment and nutrient regeneration stimulate bacterioplankton growth[J]. Microbial Ecology，1995，29（3）：221-230.
[21]Pearce D A，Van Der Gast C J，Woodward K，et al. Significant changes in the bac，terioplankton community structure of a maritime Antarctic freshwater lake following nutrient eichment[J]. Microbiology，2005，151（Pt 10）：3237-3248.
[22]董娟，李大平，陶勇，等. 氮磷胁迫下藻-菌群落的变化研究[J]. 环境科学与技术，2012（12）：40-45，55.
[23]Leamaster，R B，Walsh，et al. Cold stress-induced changes in the aerobic heterotrophic gastrointestinal tract bacterial flora of red hybrid tilapia[J]. Journal of Fish Biology，1997，50：770-780.
[24]黄光祥. 养殖鱼肠道菌群分子生态的研究[D]. 武汉：华中农业大学，2008.
[25]Hamid，A，Sakata，et al. Mieroflora in the alimentary tract of gray mullet-A comparison of the mullet intestinal microflora in fresh and sea water[J]. Bull Jop Soc Sci Fish，1978，44（1）：53-57.
[26]張皓. 养殖环境微生物群落的动态变化及与水环境的互作[D]. 苏州：苏州大学，2015.
[27]凌泽春，杨红玲，孙云章，等. 斜带石斑鱼幼鱼消化道与养殖水体中可培养菌群的研究[J]. 大连水产学院学报，2009，24（6）：497-503.
[28]刘富平. 槟榔根际溶磷微生物与菌肥制备基础研究[D]. 天津：天津大学，2014.
[29]傅雪军，马绍赛，朱建新，等. 封闭式循环水养殖系统水处理效率及半滑舌鳎养殖效果分析[J]. 环境工程学报，2011，5（4）：745-751.
[30]Hao X R，Lin Q M. A review of phosphate-dissolving microorganisms[J]. Soil and Fertilizer Sciences in China，2001（3）：7-11.郑坚强，韩素娜，时锦锦，等. 西方许旺酵母菌产双加氧酶的发酵条件研究[J]. 江苏农业科学，2017，45（12）：124-131.