工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司），SW-064紫外分光光度计（上海佑科），HZQ-F160A高低温恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），MLS-3750高压蒸汽灭菌器（三洋电机株式会社（日本）），AL204-1C型电子分析天平（梅特勒-托利多），AA6 300型原子吸收分光光度计（日本岛津公司），超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
2 试验方法
2.1 富铁锌酵母菌株的选育
将富含酵母菌的溶液梯度稀释涂布至YPD平板培养基中，培养一段时间后，挑取单菌落于显微镜下进行形态学观察。挑取酵母菌株单菌落于YPD液体培养基中进行扩大培养，并再一次涂布至平板培养基中，得目标酵母菌株[6]。将酵母菌株分别接种至含硫酸亚铁和硫酸锌的YPD液体培养基中，浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL和1.8 mg/mL。将筛选出的耐铁、锌酵母菌株接种至筛选培养基中培养后测定酵母菌OD值和生物量。
2.2 酵母菌铁、锌含量的测定
分别取5 mL初始酵母液体培养基及等量富铁锌的酵母液体培养基，进行离心处理并用蒸馏水洗涤，置于冷冻瓶内利用冷冻干燥机进行干粉化处理。
铁含量的测定：取0.3 g富铁锌酵母制备25 mL悬浮液（其包含20 mmol/L MgCl2·6H2O，10%甘油，pH为8.6的0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液20 mL），将富铁锌酵母细胞进行超声破碎，并以6 000 r/min离心20 min。每mL上清液中加入0.6 g硫酸铵，置于4 ℃冰箱静置12 h，最终以6 000 r/min离心15 min。取第一次离心后的沉淀和含铁蛋白于60 ℃烘3 h，测定铁含量[7]。
锌含量的测定：取0.3 g富铁锌酵母制备25 mL悬浮液（其包含20 mmol/L MgCl2·6H2O，10%甘油，pH为7.0的0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液20 mL），将富铁锌酵母细胞进行超声破碎，并6 000 r/min离心20 min。每mL上清液中加入0.6 g硫酸铵，振荡10 min后静置，最终以6 000 r/min离心15 min。取第一次离心后的沉淀和含锌蛋白于60 ℃烘3 h，测定锌含量[7]。
2.3 富铁锌酵母活性干粉的制备
预设定3个离心转速（4 000、6 000、8 000 r/min）及2个离心时间（10、20 min）确定离心条件[8]。利用无菌水对沉淀进行两次洗涤，并离心。取沉淀于冷冻瓶内利用冷冻干燥机进行干粉化处理，得酵母菌株干粉。
菌株离心得率及损失率的测定：首先计算出菌液中的酵母活菌数，然后将40 mL的菌液加入至50 mL离心管中，按上述离心条件进行离心处理，最终检测沉淀中活菌的数目。
2.4 复水活化最佳葡萄糖浓度及复水活化时间的确定
葡萄糖浓度梯度设定为0、2%、4%、6%和8%，依次称取0.3 g活性酵母干粉，分别加入至10 mL灭菌后的离心管中，向5支离心管中加入5 mL无菌水，并于30 ℃复水活化30 min，检测活菌数目。称取0.3 g活性干酵母粉，加入10 mL葡萄糖溶液于40 ℃下复水活化，每隔5 min镜检富铁锌酵母是否出芽，以此确定活化时间[9]。
3 结果与分析
3.1 铁、锌离子浓度对酵母菌株生长的影响
经试验发现，在相同浓度条件下，驯化后的酵母菌株比没有驯化的酵母菌株生长情况更好，铁、锌离子对所筛选出的酵母菌株的生长具有促进作用，见表1、2。
通过表1可知，当培养基中铁浓度为0.6 mg/mL时，酵母菌株生物量最大，OD值为0.27，但与铁浓度为0.8、1.0 mg/mL时，差别并不很大。因此培养基中硫酸亚铁添加量范围应为0.6～1.0 mg/mL。
结合表2生物量及OD值可知，当培养基中锌浓度为0.8 mg/mL时，酵母菌株生物量最大，OD值为0.40。当锌浓度分别为1.0 mg/mL、1.6 mg/mL时，三者数值相差不大。因此培养基中硫酸锌添加量范围应为0.8～1.6 mg/mL。
3.2 富铁锌酵母铁锌含量的测定
培养基铁、锌离子浓度对菌株铁含量的影响如图1、2所示。由图1可知，初始酵母菌株铁含量为6 mg/100 g，富铁锌酵母菌株随着培养基中铁离子浓度的增大，菌株铁含量总体上呈现上升的趋势。从图2来看，初始酵母菌株锌含量为2 mg/100 g，菌株锌含量初始阶段也随着培养基中锌离子浓度的增大而变大，当锌浓度达到1.4 mg/mL时为最大值。结合表1、2确定培养基中最适硫酸亚铁添加量为1.0 mg/mL，最适硫酸锌添加量为1.6 mg/mL。
3.3 离心条件的确定
离心转速、时间对酵母菌株的影响见表3。由表3可知，随着离心转速及离心时间的不断增加，离心损失率呈现出先降低后升高的趋势。当离心转速及时间分别设定为6 000 r/min、10 min时，离心得率最大，为98.94%，倘若随后继续增大离心转速或是离心时间，离心得率反而会下降，减少了菌液中活菌数。因而确定最优离心转速为6 000 r/min，离心时间为10 min。
3.4 复水活化最佳葡萄糖浓度的确定
葡萄糖浓度对复水活化的影响如图3所示。由图3可得，当葡萄糖浓度在0～4%时，菌液中活菌数目呈现增加趋势，当葡萄糖浓度在4%～8%时，菌液中活菌数目呈现下降趋势，故设定最佳葡萄糖浓度为4%。
3.5 复水活化时间的确定
经试验发现，从复水活化5 min开始检测，随着时间的逐渐增加，当复水活化时间达30 min时，富铁锌酵母菌株开始出芽，到达40 min时菌株出芽数较多。故设定30～40 min为富铁锌酵母菌株复水活化最佳时间。
4 结语
本试验通过对酵母菌株进行梯度驯化，最终获得富铁锌酵母菌株。当培养基中硫酸亚铁添加量1.0 mg/mL，硫酸锌添加量1.6 mg/mL，此时菌株有机铁含量为23 mg/100 g，有机锌含量为3.3 mg/100 g，对照菌株铁含量为6 mg/100 g，锌含量为2 mg/100 g，故富集培养后菌株的铁锌含量得到了一定幅度的提高。进行活性干粉的制备时，通过探究不同离心转速及时间对菌株的影响，确定离心条件为6 000 r/min，离心10 min，离心得率为98.94%。通过对干酵母复水活化的葡萄糖浓度的试验，得最优葡萄糖浓度为4%，复水活化时间为30～40 min。
参考文献：
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[2]郭雪娜，崔 黎，王肇悦，等. 富集微量元素的功能酵母研究概况及应用前景[J]. 食品与发酵工业，2009（4）：124-127.
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[4]王 旭，郑 晶，李龙雪，等.富微量元素酵母及培养条件的研究[J].中国卫生检验杂志，2014（4）：512-514，518.
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[6]刘建军，杨其义，赵祥颖，等.土壤中產木糖醇酵母菌株的筛选其发酵条件优化[J].现代食品科技，2013（7）：1632-1637，1476.
[7]魏 薇，姜炯炯，冯绪坤. HACH粉枕试剂快速测铁法与邻菲啰啉分光光度法测铁的比较[J].环境研究与监测，2014（2）：40-42，50.
[8]齐小雨，陈 熙，张 炜. 人溶菌酶重组酵母工程菌的构建和活性干粉的制备[J].江苏农业学报，2016（5）：1122-1127.
[9]王学锋.优选酿酒酵母活性干粉的制备[D].杨凌：西北农林科技大学，2010.
作者简介：邱志超（1997—），男；专业方向为生物工程。