工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；3111型CO2孵箱（美国thermo forma公司）；CKX41倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；Wellscan MK 3酶标仪（芬兰Thermo公司）； mycycler扩增仪（美国BIO-ROD公司）；7500型定量PCR仪（美国ABI公司）。
2方法
2.1细胞分组取3～6代生长良好的细胞随机分为空白对照组，LPS 模型组（LPS 1 mg·L-1），葛根素预处理+LPS组（葛根素100，200，400 μmol·L-1预处理细胞24 h后，换含 LPS 1 mg·L-1培养基孵育细胞24 h）。各组在相同的时间点加入LPS（空白对照组加入等量PBS）。
2.2药物制备葛根素液用DMEM培养液配制，将葛根素粉末溶于含10%胎牛血清、 100 U·mL-1青霉素、链霉素的DMEM培养基中。配成终浓度为4 800 μmol·L-1原液，-20 ℃长期保存，使用时用相同的DMEM培养液稀释成所需浓度。
2.3药物细胞毒性实验取对数生长期 RAW264.7细胞，0.25 g·L-1胰酶-EDTA 消化细胞后，调节细胞密度为5×104个/mL，均匀加入 96 孔培养板内，每孔 100 μL，置 37 ℃，5% CO2孵箱培养24 h。吸除旧培养液，用新的100 μL培养液按10倍梯度将葛根素稀释为不同浓度（0～4 800 μmol·L-1）， 加入细胞培养板中， 每个药物稀释浓度平行做 6个复孔。于37 ℃，5%CO2培养箱中培养24 h后，加入 10 μL CCK-8溶液，培养4 h。在 450 nm处检测各孔的吸光度。实验重复3次以上。用改进寇氏法计算药物最大无毒浓度（TC0） 和半数中毒浓度（TC50）。
2.4RAW 264.7 细胞活力的检测调整 RAW264.7细胞悬液密度为5×104个/mL，加入 96 孔培养板内，每孔100 μL，置37 ℃，5%CO2孵箱培养24 h。吸除旧培养液，根据细胞分组处理，每组均设6个复孔，继续培养 24 h。加入 10 μL CCK-8溶液，培养4 h。在 450 nm处检测各孔的吸光度。实验重复3次以上。
2.5细胞形态学检测调整 RAW264.7细胞悬液密度为2×105个/mL，加入24孔培养板中，每孔1 mL，置 37 ℃，5%CO2孵箱培养24 h。吸除旧培养液，根据细胞分组处理后，取培养上清，离心去除细胞沉淀，-20 ℃保存，贴壁细胞用预冷的PBS液洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min后，按照Giemsa试剂盒说明常规细胞染色，预冷的PBS液洗3遍后，倒置显微镜下观察细胞形态变化。
2.6TNF-α及MIP- 2的检测取-20 ℃保存的细胞上清液，采用酶联免疫试剂盒检测TNF-α及MIP- 2含量。
2.7测定NF-κB p65 的表达RAW264.7细胞2×106个/mL加入6孔板中，每孔2 mL，根据细胞分组处理后，吸除培养液，TRIzol法提取总RNA后，按照RT 逆转录试剂盒操作说明将总RNA逆转录成cDNA，置-80 ℃冰箱保存。按照SYBR Green PCR试剂盒说明扩增NF-κB p65 （引物序列见表1）。
2.8统计学处理实验数据用x±s表示，采用 SPSS 13.0软件进行统计学分析。各组间数据的比较用One-Way ANOVA，两两比较用 least significant differenced（LSD）法。P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1药物对细胞的毒性测定检测药物的最大无毒浓度（TC0） 为520.361 μmol·L-1，半数毒性浓度（TC50） 为5 451.77 μmol·L-1。
3.2RAW 264.7 细胞活力的检测与对照组比较，LPS组以及葛根素不同浓度组均未显示出细胞毒性作用（图1）。
3.3细胞形态学检测倒置显微镜下观察，未经LPS刺激的RAW264.7细胞体积较小，成球形，少部分成梭形。LPS（1 mg·L-1）刺激后细胞形态向成树突状改变（具体表现为胞体增大，形态不规则，伪足大量伸出），葛根素100 μmol·L-1组干预后可明显抑制LPS导致的细胞形态学变化，葛根素200，400 μmol·L-1干预组的抑制效果更显著，但最大剂量组仍未达到LPS刺激前的形态（图2）。
3.4各组 RAW 264.7细胞上清液 TNF-α及MIP-2检测结果比较同对照组相比， LPS（1 mg·L-1）刺激24 h后 RAW 264.7细胞上清液中 TNF-α及MIP-2含量显著升高（P< 0.05） ，而经过不同浓度的葛根素（100，200，400 μmol·L-1）预处理24 h后，RAW264.7细胞上清液中MIP-2，TNF-α的释放受到明显抑制（P<0.05），并呈现一定的剂量依赖性（表 2）。
3.5NF-κB p65 的表达将各组Ct值（threshold cycle，循环阈值）经统计学处理，具有统计学差异的（P<0.05），行2-ΔΔCt公式法相对定量，结果以相对倍数表示（表3）。同对照组相比，LPS组中NF-κB p65表达量明显上升，达到对照组的12.99倍，而经过葛根素100 μmol· L-1预处理后，NF-κB p65的释放受到明显抑制，下降到对照组的6.49倍，葛根素200，400 μmol·L-1干预组的抑制差异的（P<0.05），但最大剂量组NF-κB p65的释放仍未达到LPS刺激前的水平（P<0.05）。
4讨论
ARDS是一种临床上常见的危重症，病死率极高，其发病机制极其复杂，迄今尚未阐明。近年来随着失控的炎症反应引发ARDS这一中心机制被广泛接受，参与炎症反应的炎症细胞和细胞因子及其可能的信号转导途径成为了研究的热点。研究证实巨噬细胞在ARDS的发生、发展中起到关键角色，活化后的巨噬细胞可通过分泌多种炎性介质介导炎症反应及组织修复[6]。在炎症反应的早期，巨噬细胞可释放中性粒细胞（PMN）活化因子，如IL-l，IL-6，IL-8，TNF-α等，进一步的激活自身和PMN[7]。从而导致失控的炎症损伤反应。而在巨噬细胞释放的一系列炎症因子中，TNF-α和IL-8的作用尤其重要。TNF-α被称为炎症反应的始动因子[8]， 研究表明TNF-α是ARDS发病中最先升高的炎症因子。TNF-α通过刺激趋化因子释放和上调黏附分子表达，促使巨噬细胞和中性粒细胞的趋化及附壁，同时TNF-α还能刺激成纤维细胞的增生，能诱导多种炎症介质的释放，还能通过调节多种细胞的凋亡[9-11]。参与到炎症的损伤和修复中。ARDS特征性标志是PMN的聚集，PMN的聚集很大程度上直接由趋化因子决定。巨噬细胞是气道趋化因子的主要来源。IL-8是已知的人类最强的趋化因子，是PMN趋化入肺的关键因子，而在鼠类中扮演着IL-8角色的趋化因子为MIP-2[12]。本实验发现未经LPS刺激的巨噬细胞仅产生极其微量TNF-α和MIP-2，经LPS刺激24 h后，巨噬细胞释放TNF-α及MIP-2的能力明显加强，表明了LPS诱导了巨噬细胞的炎症性反应。
目前认为真核细胞转录因子NF-κB是 ALI 炎症反应的主要炎症介质和转录因子，在细胞因子瀑布效应中发挥着开关作用。NF-κB的持续活化与肺损伤的严重程度有关，在 ALI 的炎症介质网络调控中起中心环节作用[13]。本实验发现经LPS刺激后，巨噬细胞内的NF-κB p65 mRNA升高显著（比对照组升高12.99倍左右），与经LPS刺激后TNF-α及MIP-2的升高比例呈一定的对应关系，猜测NF-κB可能是LPS活化巨噬细胞产生炎症介质的重要通路。
葛根素是由豆科植物野葛或甘葛藤根中提出的一种黄酮苷，属于植物雌激素类。目前广泛用于心血管方面的治疗，具有扩张心血管、降低心肌耗氧、改善心脏功能的作用[14]。近年对其进一步的研究发现，葛根素具有抗氧化应激、 抗肿瘤、改善胰岛素抵抗等作用[15-18]。但目前对葛根素抗炎及其可能的机制研究较少，对其能否应用到呼吸重症医学的研究尚待深入。本实验发现，葛根素可呈浓度依赖性的下调TNF-α及MIP-2炎症因子的过度表达。这与其对巨噬细胞内的NF-κB的表达的影响存在着一定的对应关系，推测葛根素是通过对NF-κB表达的调控达到对抗炎症因子过度释放的目的。此外，葛根素通过抑制巨噬细胞增大，伪足增多等形态学的改变，降低了其吞噬能力，进一步达到对抗炎症的目的。
综上所述，葛根素预处理可抑制NF-κB p65表达，进而降低其下游炎症因子TNF-α及MIP-2的分泌，发挥抗炎作用，然而，葛根素具体是作用在哪些转导通路，发挥其抗炎作用，还需要进一步研究证实。
[参考文献]
[1]Weinacker A B，Vaszar L T. Acute respiratory distress syndrome： physiology and new management strategies[J]. Annu Rev Med， 2001，52：221.
[2]Rubins J B. Alveolar macrophages： wielding the double-edged sword of inflammation[J]. Am J Respir Crit Care Med， 2003，167（2）：103.
[3]Rubenfeld G D. Incidence and outcomes of acute lung injury[J]. N Engl J Med， 2005，353（16）：1685.
[4]B Byl， P Clevenbergh， A Kentos，et al. Ceftazidime- and imipenem-induced endotoxin release during treatment of gram-negative infections[J]. J Clin Microbiol Infect Dis， 2001，20：804.
[5]Park K H， Park Y D， Han J M ， et al. Anti-atherosclerotic and anti-inflammatory activities of catecholic xanthones and flavonoids isolated from Cudrania tricuspidata[J]. Bioorgan Med ChemLett， 2006，16（ 21） ： 5580.
[6]Beatrice B，Reto S，Thomas P，et a1.Alveolar macrophages regulate neutrophil reemitant in endotoxin-induced lung injury[J].Respir Res，2005，6：61.
[7]Goannoudis P V. Current eoncepts of the inflammatory response after major leaumar an update[J].Injury，2003，34（6）：397.
[8]song Y， Ao L， Raeburn C D， et al. A low level of TNF-alpha mediates hemorrhage-induced acute lung injury via p55 TNF receptor[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2001，281（3）：L677.
[9]Haddad el B. Differential effects of ebselen on neutrophil recruitment， chemokine， and inflammatory mediator expression in a rat model of lipopolysaccharide-induced pulmonary inflammation[J].J Immunol， 2002，169（2）： 974.
[10]Knaus W A. The ongoing mystery of ARDS[J]. Intensive Care Med， 1996，22（6）： 517.
[11]Dunican A L.TNFalpha-induced suppression of PMN apoptosis is mediated through interleukin-8 production[J]. Shock， 2000，14（3）：284.
[12]Frevert C W， Farone A， Danaee H，et al. Functional characterization of rat chemokine macrophage inflammatory protein-2[J]. Inflammation， 1998，19：133.
[13]Aghai Z H. Dexamethasone suppresses expression of nuclear factor-kappaB in the cells of tracheobronchial lavage fluid in premature neonates with respiratory distress[J]. Pediatr Res， 2006，59（6）： 811.
[14]张晓丹，赵凤华，张秀梅，等.葛根素通过线粒体途径诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡[J].中国中药杂志，2011，36（16）：2255.
[15]Hwang Y P， H G Jeong. Mechanism of phytoestrogen puerarin-mediated cytoprotection following oxidative injury： estrogen receptor-dependent up-regulation of PI3K/Akt and HO-1[J]. Toxicol Appl Pharmacol， 2008，233（3）：371.
[16]Yu Z ，Li W. Induction of apoptosis by puerarin in colon cancer H T229 cells[J]. Cancer Lett， 2006，238 （1） ：53.
[17]Choi J. Effect of kaikasaponin III obtained from Pueraria thunbergiana flowers on serum and hepatic lipid peroxides and tissue factor activity in the streptozotocin-induced diabetic rat[J]. J Med Food， 2004，7（1）： 31.
[18]程月发，朱国旗，关亚丽，等.葛根素对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒途径凋亡的保护作用[J].中国中药杂志，2011，36（9）：1222.
Effect of pretreatment with puerarin on activation of LPS-induced RAW264.7 cells
HU Jian-jun， ZHANG Dan-dan， CHEN Jun-jie， CHEN Cheng-shui*， LI Yu-ping
（Department of Respiratory， First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000， China）
[Abstract]Objective： To observe the effect of pretreatment with puerarin on activation of LPS -induced RAW264.7 cells and secretory cytokines， and discuss its anti-inflammatory mechanism. Method： Well-grown RAW264.7 cells in the exponential phase were collected and randomly divided them into the blank control group， the LPS group and the puerarin pretreatment+LPS group. The cellular toxic effect of puerarin on RAW264.7 cells was examined by CCK-8 assay， cell morphology was detected by Giemsa stain method， the changes in TNF-α and MIP-2 were tested by ELISA， and the expression of NF-κB p65 mRNA were determined by qRT-PCR. Result： When puerarin was cultured with 1 mg·L-1 LPS at a concentration of lower than 400 μmol·L-1， it had not showed the cellular toxic effect （P<0.05）. Compared with the control group， the LPS group could significantly change the morphology of RAW264.7 cells （increase in cell body， irregular shape， with a large number of pseudopodia extending）. After intervention， the puerarin 100 μmol·L-1 group could significantly inhibit LPS-induced cell morphological changes， while the puerarin 200 μmol·L-1 and 400 μmol·L-1 puerarin groups showed more notable inhibitory effects. However， there was no obvious difference between the two groups. The pretreatment with puerarin could inhibit the expression of TNF-α and MIP-2 in cell supernatant and NF-κB p65 mRNA in cells （P<0.05）. With increase in the puerarin concentration， its inhibitory effect gradually grew （P<0.05）， but did not reach the level of the blank control group. Conclusion： As a safe and effective natural anti-inflammatory drug， puerarin can significantly reduce the expression of inflammatory cytokines （TNF-α， MIP-2）. Its mechanism may be related to the reduction of NF-κB p65 mRNA expression.
[Key words]puerarin； RAW264.7 cell； lipopolysacchride （LPS）； NF-κB
[责任编辑张宁宁]