基础信息。此外，本研究还可了解与UVJ和SST上皮细胞相关联的碳水化合物成分的分布情况。
1 材料和方法
1.1 试验动物
试验采用罗斯308肉种鸡，按标准饲养条件饲养（Aviagen公司生产）；20周龄时转入蛋鸡笼，进行单笼饲养，鸡舍环境可控；21周起进行光照刺激（光周期为14 h光照∶10 h黑暗）。母鸡在24周龄时进行首次人工授精，此后每周进行一次人工授精，每次输入3亿个精子（3×108个）。每天收集种蛋并储存在 18 ℃的冷藏室中，每周孵化，照蛋检测种蛋的受精情况。本研究中，受精率在90%以上者设为高受精率个体，低于80%以下者为低受精率个体。
1.2 组织收集和组织学
母鸡在产蛋第6周（n=5）、第11周（n=4）、第14周（n=8）和第16周（n=7）后采用颈脱位法实施安乐死，随后将子宫和阴道作为一个整体分离。另一组6羽未产蛋母鸡同样在产蛋后第6周实施安乐死。去除包围子宫和阴道后端的结缔组织，露出UVJ，用立体显微镜定位SST（Bakst，1992）。从每羽母鸡中分离2～4块含有SST的UVJ黏膜样本，随后放入10%中性缓冲福尔马林（Neutral Buffered Formalin，NBF）中固定。
经过24 h～48 h的固定后，样品转移到浓度为70%（V/V）的乙醇溶液中，每30 min更换一次乙醇，共更换2次，然后转移到自动化系统的组织处理器中，最后用石蜡包埋。每个样本切4～6个切片、每片厚4 μm，并依次收集到载玻片上，置于37 ℃的暖托盘中风干，在室温条件下储存直到切片染色。染色包括苏木精和曙红（H&E；Llewellyn，2009）、PAS反应（Bancroft和Stevens，1982）、凝集素组化反应（Apichela等，2010）。使用配备了QICam数码相机并采用NIS软件操作系统的Zeiss Axioskop显微镜进行普通光和荧光显微镜镜检。
1.3 凝集素组化反应
表1列出了本研究使用的凝集素、凝集素结合的碳水化合物成分、荧光结合物、浓度和各自相应的碳水化合物抑制剂。利用处理好的每组切片准备两个阴性对照：一个切片孵育时不加凝集素，以证明自显荧光细胞；另一切片加入凝集素以及其抑制糖，孵育时间至少40 min。
凝集素标记根据Apichela等（2010）的方法并略作修改进行；简言之，切片脱蜡（二甲苯中洗涤两次，每次10 min）后，在一组浓度呈梯度下降的酒精中（100%乙醇，2次×5 min/次；95%乙醇，1次×2 min/次；70%乙醇，1次×2 min/次）进行再水化，然后在去离子水中洗涤多次以除去过量的乙醇。之后在10 mM的Tris-HCl缓冲盐水（pH 7.4）中孵育10 min，如有必要补充含有0.1 mM CaCl2、0.1 mM MnCl2、0.01 mM MgCl2或者 0.1 mM ZnCl2的TBS+（表1）。
TBS+组织随后在优化的浓度中（表1）使用单种凝集素进行标记，时间为35 min～ 60 min；切片用TBS液洗涤3次，每次10 min，然后使用去离子水再洗涤3 min，以除去多余的盐分。对于双重凝集素标记实验，此步骤重复一次。盖玻片用Prolong Gold封固剂固定。荧光结合凝集素标记开始后，切片避光保存。
切片会在室温下黑暗环境中储存24 h，使封固剂凝固；随后盖玻片的边缘使用指甲油将其密封起来，使切片能在4 ℃环境下长时间储存以便于观察和成像。切片成像在标记后1周内完成。之后切片可用Zeiss Axioskop显微镜观察，也可以用激光扫描共聚焦显微镜进行观察，该显微镜使用的是一种具有Zen 2012 64位图像采集和处理软件的Axio观测器LMS 780。
凝集素标记的强度评分分为阴性（-）即不显荧光、（+/-）即同类细胞显荧光不一致、阳性（+）即荧光明显，以及（++）即荧光明亮且一致。
2 结果
虽然UVJ的表面上皮细胞是由柱状分泌细胞和纤毛细胞组成的假复层，但起源于UVJ表面上皮细胞管状内陷的SST却是由非分泌、无纤毛的柱状上皮细胞组成。
包围SST和下层UVJ上皮细胞的疏松结缔组织含有多种类型的细胞和结缔组织纤维（图1a和1b）。该SST主要位于黏膜皱襞的上部，但偶尔也可在连接相邻的褶皱的基底黏膜处观察到（图1b）。该SST中的精子群集——精子密集聚合地挤成一群群，几乎按与SST长轴平行的方向排列，且头朝SST的基部——在被检测母鸡偶尔可观察到（图1a）。
表2列出了凝集素与排列在UVJ和SST中的上皮细胞的结合亲和力。因为在SST中观察到相对较少的精子，精子-凝集素的结合亲和力在本研究没有探讨。凝集素结合模式在未产蛋母鸡、授精的青年母鸡和老龄鸡之间没有明显差异，只是在高受精率和低受精率的母鸡之间观察到鸡冠刺桐凝集素（Erythrina Cristagalli，ECL）结合方式存在细微差别（表1，下文将讨论）。
有证据表明，凝集素与这2种上皮细胞顶端表面的结合方式有差异。用GSL-II和WGA鉴定出含有复合糖的N-乙酰葡糖胺，二者有着几乎相同的结合特性。WGA对UVJ和SST的上皮顶端表面都有很强的结合能力 （图1a和图2a～2d） 。
自上而下观察SST内腔的顶端面，WGA似乎表现出能特异性结合SST顶端微绒毛 （图2b）。GSL-II仅限于结合SST上皮細胞细胞质，并断断续续地结合SST顶端表面和UVJ上皮细胞的细胞质（图2c）。
半乳糖和N-乙酰半乳糖胺中是否有复合糖的证据在检测的6个凝集素试验中不一致（表2）；另外，在一定程度上，在高受精率和低受精率的母鸡间也不一致。WFA结合SST上皮细胞的方式与WGA的结合方式大致相同，不过与WGA比较，SST微绒毛并不能一致地与WFA结合，且结合的强度也不及WGA（图3a～3c）。
ECL（图3d）和大豆中的凝集素（Soybean，SBA）（图2c和2d）对SST上皮细胞顶端面的结合既有阴性的也有阳性的，这表明不同SST上皮细胞对半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分的表达存在差异。像LTL一样，WBA-I能结合到UVJ上皮细胞的顶端及基底膜（程度较小），但却不能与SST上皮细胞结合。在高受精率或低受精率母鸡的SST上皮细胞结合模式上，只有ECL表现出轻微且可检测到的差别。
在高受精率的母鸡中，ECL断断续续地与SST微绒毛结合：一些SST上皮细胞带有强荧光，一些是阴性的（图3d）。在低受精率母鸡中，ECL不与SST微绒毛结合；另外，无论是高受精率还是低受精率的母鸡，ECL都不能与它们的UVJ上皮细胞顶端面结合。
含复合糖的甘露糖用Con-A进行鉴定（表2）；疏松结缔组织及SST黏膜下层细胞中的甘露糖大部分表现为一致的阳性。在检测的这二种上皮细胞中，Con-A的结合不一致或呈阳性；当进行双重染色时，Con-A的结合产生与其他凝集素（图3a、3b和3d）不同的背景。含N-乙酰神经氨酸部分的复合糖用SNA定位（表2）。
SNA分布在整个UVJ上皮细胞中；但没有分布在SST上皮细胞的侧向细胞膜上，且紧密地结合在SST顶端的微绒毛上。虽然莲花豆凝集素（Lotus Tetragonolobus，LTL）（岩藻糖亲和力）定位在UVJ上皮细胞的纤毛上，然而LTL既不与SST上皮细胞的顶端面及细胞质结合，也不与SST上皮细胞的侧面和基底膜结合（表2）。
3 讨论
本研究鉴定了与UVJ和SST上皮细胞复合糖有关的细胞内和细胞外碳水化合物成分；观测了凝集素与这两种上皮细胞的结合模式之间的差异。然而，凝集素在与未产蛋母鸡与授精的青年母鸡、老龄母鸡的这二种上皮细胞的结合模式上不存在差异；仅ECL与高受精率和低受精率母鸡的SST上皮结合模式上有微小的差异。WFA和ECL与相互毗邻的SST上皮细胞顶面的结合模式存在差异，这表明SST上皮细胞并不能一致地合成对这些凝集素有特异性的复合糖和碳水化合物成分。
ECL、SBA和WFL三种凝集素与含有半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分的碳水化合物结构的亲和力及WGA一种凝集素与含有N-乙酰氨基葡萄糖成分的碳水化合物结构的亲和力，都与SST顶端微绒毛密切相关。对N-乙酰神经氨酸有特异性的SNA表现为与SST顶面有很小的结合力。这一结果间接地支持了Steele和Wishart（1996）的观测结果，他们将鸡的精子与神经氨酸苷酶一起孵育，然后将神经氨酸苷酶处理过的精子输入母鸡体内，结果发现SST内几乎没有精子。
然而，当把这些用神经氨酸苷酶处理过的精子与UVJ-SST组织块在体外一起孵育时，却在SST中观察到了精子。因此，可以认为精子质膜表层上的复合糖，其所含的终端神经氨酸对精子与SST上皮细胞顶端微绒毛的结合上并不是必需的。
在一个类似的研究中，研究人员计划利用酶切方法切除鸡和火鸡精子质膜中的半乳糖和N-乙酰半乳糖胺，然后人工授精，并同时与含有SST的UVJ黏膜共同孵育。该研究将能够证明精子上的这些碳水化合物在其与SST上皮细胞结合并维持母鸡受精上的作用。半乳糖和N-乙酰半乳糖胺已被證实在骆驼（Apichela等，2010）和猪（Talevi和Gualtieri，2010）中参与精子与排列在峡部的上皮细胞的结合。
目前对SST上皮细胞与居留其中的精子之间细胞与分子的互作机制还很不清楚。尽管Ahammad等（2010）认为鸡精子在通过雄性生殖系统时，在经过了一种特异的配体—受体相互作用后能够与SST上皮细胞结合，这种与精子储存和维持活力有关的结合其意义也仅仅是推测。
如与小鼠上获得的结果（Fazeli等，2004）一样，精子结合到SST上皮细胞有可能会开启信号传导通路，这种通路能修改SST上皮细胞的基因表达。本实验室正在对这种可能性进行研究，我们正在解析从未产蛋母鸡、高受精率及低受精率的肉种鸡中分离SST上皮细胞的转录谱信息。
Bakst（1992）报道，在UVJ黏膜的压片制备中，精子束内的精子表现出一种同步、缓慢、起伏的运动，而分散在SST管腔中的精子没有这种现象。这种能够使数以百计的精子同步起伏的信号机制尚不清楚。
Tingari和Lake（1973）报道，在精子束中，覆盖在相邻且并行的精子头部的质膜似乎是黏着的；他们称之为精子凝集反应。Schuppin等（1984）同样用这一术语来描述火鸡精子束中相邻精子并列的质膜。然而，这种术语会误导人们，因为到目前为止还没有证据表明这是一种基于免疫的精子凝集反应，而仅仅是精子细胞膜紧密并排行为罢了。
最近，Bakst和Bauchan（2015）观察发现，在火鸡SST内的精子束中，除了在这两块质膜紧密并列的区域中外，覆盖在核和中段上的精子质膜呈褶状起状。虽然不像是细胞接合，但是邻近精子间紧密并列的质膜可能在精子-精子的通信上发挥一定的作用，特别是在使精子束中的精子以同步并行排列的方式缓慢起伏的移动上发挥一定的作用。
存在一种可能性，即精子通过糖配体与SST微绒毛结合，这可能几乎对延长精子在输卵管中的储存能力没有作用。与哺乳动物的每个精子都结合到峡部上皮细胞不同，位于鸡精子束中心的精子似乎与SST上皮细胞没有直接接触。考虑到估计392个鸡精子在SST中包装成的一个精子束（Zavaleta和Ogasawara，1987），那么很明显只有那些毗邻SST上皮细胞的精子才可能与SST结合和交流。
Froman（2003）提出了一个描述精子储存在SST中以及从SST中释放的模型，该模型仅与精子的运动能力有关，并不涉及到精子与SST上皮细胞的直接交流。简单地说，按照Froman模型，只要精子向上游动的速度可以大到足以抵抗从SST底部向其开口处产生的液体流，精子就可以进入SST且停留在其中。如果精子游动速度低于从SST中的液体流向UVJ腔流动的速度，精子就会被冲出SST。
尽管有关精子储存的Froman模型没有包括精子与SST上皮结合的作用，但它可以解释精子束形成及随后精子在SST中分散的现象。如Froman（2003）所说，精子利用其移动速度快于流出SST的液体流的速度来进入SST。
这里我们可以认为，这些精子在聚集到SST管腔底部前会穿过SST；精子会继续沿SST长轴方向并行排列，同时头部朝向SST管底部，形成一个缓慢起伏的精子束。该精子束一直保持着，直到单个精子的游动速度低于通过SST管腔的液体流的速度为止。这些移动速度较低的精子逐渐从精束中脱离，并分散到SST中或从SST排出。如果精子接受了来自UVJ上皮细胞的信号，那么它可能通过来自由SST上皮细胞顶端产生并释放出来的SST上皮细胞或微绒毛泡的液体（Bakst和Bauchard，2014）。
综上，本文研究了与SST上皮细胞顶面复合糖相关的半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分。这些复合糖或其他尚需鉴定的SST上皮细胞表面的复合糖是否在精子进入SST并从中释放出来发挥了一定的作用，目前正在研究。