基础。
关键词：反刍动物;乳杆菌;分离鉴定
中图分类号：TS201.3 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.03.014
Isolation and Identification of the Lactobacillaceae from Ruminant
ZHOU Hao1，WANG Bin1，DING Guang-ming1，ZOU Ling1， CAO Guo-jie1， SUN You-de2，SHAN Hu1， WEN Jian-xin1
（1. College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University ， Qingdao，Shandong 266109，China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Research Institute of Qingdao， Qingdao，Shandong 266100，China）
Abstract： A strain of dominant bacteria （Lactobacillus） was screened from fresh fecal samples of healthy Holstein cows， and it was identified by biochemical tests and molecular biology methods， and security testing. The test result showed that the bacteria was Gram-positive bacteria， fermented sugar alcohol test was positive， the catalyst test was positive. Lactobacillus is resistant to clarithromycin， clindamycin， penicillin， gentamicin， and can inhibit the growth of E. coli， but has no inhibitory effect on Salmonella. Animal experiments showed that the mice feeding with Lactobacillus had good normal stool without diarrhea and death， and their weight increased significantly. Ruminant-derived Lactobacillus provides with a research foundation for probiotics in the future.
Key words： ruminant; Lactobacillaceae; isolation and identification
微生态制剂是在微生态理论的指导下，经过特殊的加工工艺人工制成的活菌制剂[1]。它可以代替部分抗生素添加到动物饲料中，从而克服了动物长期饲用抗生素对肠道内正常菌群的不良影响，并且具有天然、无毒副作用、不污染环境等优点。微生态制剂的使用满足了动物生产方面的需求[2]，促进了动物生长，提高了饲料的消化和吸收，并且饲用微生态制剂后的动物产品中无残留污染[3-4]。
目前，国内外对反刍动物养殖用微生态制剂的研究比较关注，但能够用于反刍动物的饲用微生态制剂却较少。国内应用于反刍动物养殖业的微生态制剂比较繁杂，效果不一，而且多数是为人类和畜禽设计，有些微生态制剂并不适合反刍动物的体内环境，也不能被很好地吸收利用，缺少反刍动物专用的微生态制剂。为改善和提高反刍动物的抗病能力，提高繁殖性能和生产性能，最大程度地提高经济效益，对从健康牛粪便中分离的菌种进行鉴定，为反刍动物微生态制剂的研制开发奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
待检样品为从青岛某牛场采集的健康牛的新鲜粪样。
1.2 样品的分离培养
取无菌培养皿3套，倒入普通琼脂培养基，冷却。用移液枪吸取10-1稀释菌悬液200 L，滴于培养基平板上，用涂布棒将培养基上的菌液分散均匀，平板正放静置5 min，菌液稍干后，于37 ℃恒温培养18 h。
长出菌落后，观察菌落形态，根据乳杆菌的相关菌落特征，挑取疑似单菌落，疑似乳杆菌的接种于改良MC培养基、含碳酸钙的MRS培养基上，含碳酸钙的MRS培养基平板置于厌氧培养皿中，将改良MC培养基平板和厌氧培养皿放于37 ℃恒温培养箱中进行纯培养，培养18 h。
1.3 乳杆菌的鉴定
1.3.1 菌落形态特征 37 ℃恒温培养18 h后，通过改良MC培养基、含碳酸钙的MRS培养基长出的单菌落进行菌落形态特征的观察。
1.3.2 革兰氏染色 接种环经火焰灭菌后，分别挑取分离培养后的MRS培养基上的单菌落进行制片、干燥固定、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检，在油镜下观察菌的形态。
1.3.3 生理生化试验 按照常规的方法[5]对分离的菌种进行鉴定。
（1）糖或醇类发酵试验。接种环火焰灭菌后分别挑取培养18 h后的MRS培养基上的单菌落，在蜜二糖、木糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇生化反应管中分别接种上相应的菌种，将接种好的反应管于37 ℃恒温培养24 h，观察结果。
（2）生化试验包括MR试验、VP试验、吲哚试验、硫化氢试验、淀粉水解试验、脲酶试验、柠檬酸盐利用试验、三糖铁试验、触酶试验、明胶液化试验、KOH试验。
1.3.4 耐酸性试验 吸取5 mL营养肉汤注入试管中，用HCl和NaOH调节pH值，pH值分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0（对照），并做好标记。 将各种不同pH值的培养基经121 ℃灭菌20 min后备用。将MRS培养基上的菌株分别接于pH值为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0（对照）的试管中， 37 ℃恒温箱中培养24 h后，取出试管观察试管内菌液的混浊程度。
1.3.5 药敏试验 接种环经火焰灭菌后挑取MRS培养基上的单菌落，接种于营养肉汤内进行菌液培养10 h。用移液枪取200 L培养后的菌液移于普通培养基平板上，用涂布棒将菌液在培养基上涂布均匀，室温下静置5 min，将镊子经火焰灭菌后以无菌操作方法取出含药纸片贴在标有标号的培养基表面，轻轻将含药纸片与培养基表面压实。37 ℃恒温箱中培养24 h后，取出平板量取含药纸片周围抑菌环直径大小，数值用毫米数记录[6]。
1.3.6 抑菌试验 用接种环挑取致病性大肠杆菌和沙门氏菌单菌落分别接种于营养肉汤中，摇床温度采用37 ℃，转速160 r·min-1培养菌液10 h。在杯中分别加入适量MRS培养基上的菌落培养的菌液，并设置对照，在对照组牛津杯中添加适量灭菌蒸馏水。37 ℃恒温培养24 h，分别观察菌种对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌程度，量取抑菌圈直径大小[7]。
1.3.7 分子生物学鉴定 参考文献[8]，由上海生工生物工程有限公司合成了一对乳酸杆菌属特异性引物（Lacl6S正向5’—GCAGTAGGGAATCTTCCACA—3’，Lacl6S反向5’—GCTTTACGCCCAATAAATC—3’，扩增片断长度为223 bp）。
PCR反应体系：Taq酶0.5 μL，上下游引物各加1 μL，DNA模板2 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP2.5 μL，补ddH2O至体积为25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃、5 min预变性，94 ℃、30 s变性，58 ℃、30 s退火，72 ℃、1 min延伸，循环30次，72 ℃、 5 min延伸。用移液枪移取5 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中，待其电泳结束后于凝胶成像仪中观察扩增结果。
1.3.8 安全性试验 选取体质量为20～24 g的昆明系小白鼠9只，分成3组。经预试验后，将MRS培养基和TPY琼脂培养基上的菌落接种于营养肉汤中，摇床培养10 h，用培养的菌液分别对空腹8 h后的小鼠每天一次经口灌胃0.5 mL，第3组为空白对照组，对照组小鼠空腹8 h后每天一次经口灌胃0.5 mL营养肉汤。每天观察和记录，7 d结束试验后，剖检观察内脏及组织器官变化[9]。
2 结果与分析
2.1 菌落形态观察试验结果
改良MC培养基、含碳酸钙的MRS培养基上的菌落形态为（图1，图2）：中央凸起，呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，菌落不透明，白色，在含碳酸钙的培养基菌落上有溶钙圈出现。
2.2 革兰氏染色结果
MRS培养基上的菌镜检为革兰氏阳性菌，菌体形态为短杆状，有的近似球状，多呈链条状排列（图3）。
2.3 生理生化鉴定试验结果
由分离菌的菌落特征、镜检形态、生化鉴定结果（表1，表2），参照《乳酸细菌-基础、技术和应用》[10]中对乳杆菌以及《伯杰细菌鉴定手册》[11]中乳杆菌的相关试验结果，可初步鉴定改良MC培养基和MRS培养基上的菌种为乳杆菌。
2.4 耐酸性试验结果
对MRS培养基上的菌株进行不同pH值生长情况试验，试验结果表明，pH值为1.0，2.0， 3.0，4.0时，培养液摇匀后清澈，菌株在此pH值不能生长;pH值为5.0时，培养液微混，菌株生长，但生长不好;pH值为6.0和7.0时，培养液底部有白色沉淀，摇匀后混浊，菌株生长良好。
2.5 药敏试验结果
由表3可以看出，乳杆菌对克拉霉素、洁霉素、青霉素、庆大霉素等有一定的耐药性，对其余几种抗生素如氟苯尼考、四环素、诺氟沙星等则表现为敏感。
2.6 抑菌试验结果
乳杆菌对大肠杆菌有一定的抑菌作用，但对沙门氏菌无抑菌作用，其中对大肠杆菌的抑菌圈直径为14 mm，为中度敏感。
2.7 分子生物学鉴定结果
乳杆菌经PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪中观察到在220 bp处有特异性条带（图4）。
2.8 动物安全性试验结果
经过7 d的灌服观察，期间小鼠生长状况良好，精神状态正常，无死亡现象;剖检后观察到内脏组织器官无异常变化，说明菌株对小鼠无毒性。
3 结论与讨论
（1）本试验参照《乳酸细菌-基础、技术和应用》中对乳杆菌和双歧杆菌的描述以及《伯杰细菌鉴定手册》中乳杆菌相关鉴定结果的指导，通过形态特征、生理生化反应，结合分子生物学鉴定，从而确定了乳杆菌。耐酸性试验结果中，显示的耐酸性与他人研究结果不同，可能是本次试验中所调的营养肉汤pH值有误差导致的。药敏试验和抑菌试验中抑菌圈直径也与其他著作中的试验结果有所不同。
（2）关于乳杆菌的耐药性分析。临床上使用乳杆菌添加剂时，其作用效果并不一致，应注意与抗菌药物的配伍禁忌，以防止由于抗菌药物对细菌的敏感作用而影响乳杆菌添加剂的活性和功效[12-13]。
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