摘 要：研究了酿酒酵母GJ2008和酿酒酵母GGSF16不同接种比例（V/V）在酒精发酵过程中葡萄糖和果糖利用的差异性，为蔗汁木薯粉酒精发酵提供研究基础.以等质量浓度的葡萄糖与果糖（总糖220 g/L）混合进行酒精发酵，调节酿酒酵母GJ2008与GGSF16不同接种比例（10∶0，8∶2，6∶4，4∶6，2∶8，0∶10，以初始酵母数为4.0×107 CFU/mL）进行酒精发酵，测定发酵过程中总糖﹑葡萄糖﹑果糖﹑乙醇的变化，采用曲线下面积法和糖代谢一半与代谢完全所需时间法对两种糖利用差异性进行分析.结果表明：果糖的利用速率小于葡萄糖的利用速率，随着酵母菌株GGSF16接种量的增加，葡萄糖利用速率加快，整个发酵过程中，混合酵母菌株对果糖代谢的影响程度高于其对葡萄糖的影响程度；两种酵母菌株的接种比例对乙醇产量无明显影响；相比较之下，0∶10组总糖发酵效率和耗糖发酵效率均较高；因此，酿酒酵母GJ2008和GGSF16最佳接种比例为0∶10（V/V）.
关键词：混合菌种；果糖；葡萄糖；曲线下面积；酒精发酵
中图分类号：TS261.1 文献标志码：A
0 引言
将甘蔗和木薯作为燃料乙醇的候选原料已经成为近年来的研究热点[1-2]，目前国内外已有将两种原料混合进行酒精发酵的相关报道[3-5].甘蔗汁与木薯粉混合发酵过程中，甘蔗汁中蔗糖被水解成葡萄糖和果糖，木薯淀粉在糖化酶的作用下水解生成大量的葡萄糖.葡萄糖与果糖在酒精发酵过程中共用一套膜运输和酶催化体系[6-7]，而果糖对膜运输和酶催化体系的亲和度小于葡萄糖，所以两种糖在发酵过程中的利用必存在差异性.目前，酒精发酵过程中，影响葡萄糖和果糖利用差异性的因素主要有可同化氮[8]﹑糖浓度[9]﹑温度[10]﹑葡萄糖与果糖比例[11]﹑菌种性能[12]等，混合酵母对糯米酒风味改善研究也有所报道[13].而关于混合酵母菌株对葡萄糖与果糖混合发酵生产酒精过程中两糖利用差异性影响的研究尚不清楚，因此有必要对此问题开展研究.
本研究以酿酒酵母GJ2008，GGSF16为出发菌株，等质量浓度的葡萄糖和果糖混合作为发酵培養基，采用混合菌株进行酒精发酵，研究混合菌株酒精发酵过程对葡萄糖与果糖利用差异性的影响，以期为甘蔗汁与木薯粉混合酒精发酵提供参考和依据.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GJ2008和GGSF16：广西科技大学发酵工程研究所保藏.
1.1.2 培养基 斜面活化培养基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH.
一级种子培养基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH.
二级种子培养基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH.
发酵培养基：酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖±110 g/L，果糖±110 g/L，自然pH.
以上培养基均于115 ℃高压蒸汽灭菌30 min.
1.2 仪器与设备
ZWYD-2402叠式恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；LS-B35L-I立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；SBA-40生物传感仪：山东科学院生物研究所；SGD-IV全自动还原糖测定仪：山东科学院生物研究所；SW-CJ-TB标准净化工作台：苏州集团苏州安泰空气技术有限公司；Mikro220R台式冷冻离心机：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；DW-86L386立式超低温保存箱：青岛海尔特种有限公司.
1.3 方法
1.3.1 种子培养方法 将实验室保藏菌种GJ2008，GGSF16经30 ℃斜面活化1 d～2 d后分别接种至一级种子培养基中，32 ℃，120 r/min摇床培养12 h，以体积分数为10%的接种量分别转接至二级种子培养基中，32 ℃，120 r/min摇床培养10 h后，经4 000 r/min离心10 min，弃上清液得湿酵母泥，加入无菌水振荡混合制得10倍浓缩种子悬液.
1.3.2 酒精发酵方法 以原菌液体积分数为10%的接种量计，将2 mL10倍浓缩种子液接种至装液量为200 mL/500 mL的发酵培养基中，进行果糖和葡萄糖混合酒精发酵，其中酿酒酵母GJ2008与GGSF16接种比（V/V）为10∶0，8∶2，6∶4，4∶6，2∶8，0∶10.初始酵母数约4.0×107 CFU/mL，32 ℃，120 r/min摇床培养，透气膜和牛皮纸包扎封口进行非严格厌氧发酵，每组3个平行试验.发酵开始0 h，3 h，6 h以后每隔6 h取样并测CO2失重，CO2失重小于0.2 g时发酵结束.
1.3.3 成分分析方法 样品处理：取2 mL发酵液，12 000 r/min冷冻离心3 min，取上清液于-60 ℃储存，备用.
葡萄糖和乙醇含量采用生物传感分析仪测定，标准乙醇体积分数为0.075%，葡萄糖质量浓度为1 g/L，采用还原糖测定仪测定发酵液中的还原糖质量浓度.果糖质量浓度等于还原糖质量浓度减去葡萄糖质量浓度.
1.3.4 糖代谢曲线分析 运用GraphPad Prism 5.0软件绘制果糖和葡萄糖的代谢曲线，并分别获得果糖与葡萄糖代谢曲线下面积（area under the fermentation curve，AUC）[14]，记作果糖AUC和葡萄糖AUC.
运用Origin 9.0软件对糖代谢进行非线性曲线拟合，Boltmann S型函数是葡萄糖和果糖代谢拟合较好的方程，选择相关系数R2最大的函数作为其拟合方程，通过拟合方程分别计算出两种糖消耗一半和消耗完全所用的时间，记作tF50，tG50和tFend，tGend[7].
1.3.5 计算方法
总发酵效率=×100%
乙醇产率g/（L·h）=
2 结果与讨论
2.1 糖代谢时间法分析葡萄糖与果糖利用差异
图1为混合酵母菌株不同接种比例条件下葡萄糖和果糖的代谢拟合曲线，糖代谢拟合方程见表1.由图1可知，发酵6 h ～18 h，每组比值中果糖的含量总是高于葡萄糖；不同小组间，同一发酵时间，接种比值越大，果糖含量越小.等量的葡萄糖与果糖混合发酵生产乙醇，随着两菌株接种比值的减小，两糖消耗曲线逐渐拉开.采用Origin 9.0软件对两种糖代谢过程进行非线性曲线拟合，Boltmann S型函数是拟合较好的方程，见表1.由表1可知，所得到的拟合方程的R2在0.991 8～0.997 7之间，拟合程度较好，能够简单、直观地描述发酵过程中糖代谢的变化，葡萄糖和果糖代谢过程的拟合曲线类型受两菌株接种比例影响不大.
糖消耗一半和消耗完全的时间可以表示菌株对糖利用的快慢，时间越短，表示菌株对糖利用越快[6].根据表1拟合方程计算可获得葡萄糖和果糖的t50，tend值，结果见表2.由表2可知，在酵母菌株不同接种比例下，tF50和tFend一直大于tG50和tGend，表明酒精酵母对葡萄糖的嗜好性更强.随着酿酒酵母GGSF16接种量的增加，tG50随之减小，说明葡萄糖利用快慢与GGSF16接种量有关.
表3中， tnF50/t0F50，tnG50/t0G50和tnGend/t0Gend的大小表明葡萄糖与果糖的利用情况受两酵母菌种接种比例的影响程度.由表3可知，不同接种比例下tnG50/t0G50一直小于tnF50/t0F50，说明果糖的代谢受两种菌株接种比例的影响更为明显.
2.2 曲线下面积法分析葡萄糖与果糖利用差异
发酵程度的好坏可以通过糖利用情况来评估，本研究采用曲线下面积法对糖利用情况进行直观判断，AUC值越小，表示菌株对糖利用越快[14].由表4可知，两酵母菌株接种比同水平下，果糖AUC值总是大于葡萄糖AUC值；果糖AUC值随着接种比例的减小而增大，葡萄糖AUC值随着接种比例的减小而减小，表明两种菌株对葡萄糖的偏好均明显优于果糖，证明酵母菌对葡萄糖具有嗜好性，并随着酵母菌株GGSF16接种量的增大，葡萄糖代谢速度加快.
表5中，在两酵母菌株不同接种量比例下，糖利用受接种比例影响的程度可以通过糖代谢曲线下面积比值果糖AUC/果糖AUC和葡萄糖AUC/葡萄糖AUC进行比较，比值越大，表明该糖类受菌株接种比例影响程度越大[15].由表5可知，果糖AUC/果糖AUC总是大于葡萄糖AUC/葡萄糖AUC，说明酵母菌株接种比例对果糖的代谢影响更明显.
2.3 dGF /dG法分析葡萄糖与果糖利用差异
dGF/dG=[dG- dF]/ dG，即[葡萄糖消耗速率（dG）-果糖消耗速率（dF）]/葡萄糖消耗速率（dG）， dGF/dG值是衡量葡萄糖与果糖利用差异性指标之一[8，15].酵母菌株不同接种比例下葡萄糖与果糖混合发酵dGF/dG值见图2.由图2可知，发酵过程中dGF/dG值均呈减小趋势，6 h～12 h尤其明显，表明此阶段葡萄糖的利用速率大于果糖的利用速率；之后dGF/dG值不断减小直至发酵结束，说明发酵后期葡萄糖与果糖的利用差异性在不断缩小，这可能与发酵后期培养基中的可同化氮量有关[16].
2.4 混合酵母菌株不同接种比例条件下酒精发酵参数的比较分析
酵母菌株不同接种比例条件下，葡萄糖和果糖混合发酵生产酒精主要参数见表6.从残总糖质量浓度，发酵周期、酒精度、乙醇产率、总糖发酵效率及耗糖发酵效率来看，各比例小组相互之间差别不大；相比较之下，0∶10组不论是酒精度，还是乙醇产率、总糖发酵效率及耗糖发酵效率均较高，所以葡萄糖和果糖混合发酵生产乙醇，0∶10（即仅含酒精酵母GGSF16）时发酵效果最好.
3 结论
本文研究了酿酒酵母GJ2008和GGSF16接种比例对葡萄糖果糖利用差异性的影响，结果表明：发酵前中期酿酒酵母对果糖的利用速率低于其对葡萄糖的利用速率，说明酒精酵母对葡萄糖的嗜好性；隨着酵母菌株GGSF16接种量的增加，葡萄糖利用速率加快；整个发酵过程中，混合酵母菌株接种比例对果糖代谢的影响程度高于其对葡萄糖的影响程度.
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Discrepancy of fructose and glucose consumption during alcoholic fermentation by mixed strains
HUAN Qiong-sha， WU Shi-hua﹡， ZHAO Dong-ling， HUANG Cui-ji， YI Yi
（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and
Technology， Liuzhou 545006， China）
Abstract：To provide basic information of sugarcane and cassava fermentation， the inoculation proportion of S.cerevisiae GJ2008 and GGSF16 was evaluated to verify the use of glucose and fructose. The glucose and fructose medium （the total concentration was 220 g/L） with same concentration was used to conduct alcoholic fermentation. We adjusted the ratios of mixed strains of S.cerevisiae GJ2008 and GGSF16 （10∶0， 8∶2，6∶4，4∶6， 2∶8， 0∶10） to conduct alcoholic fermentation， determining total sugar， glucose， fructose and ethanol in the fermentation process， using area under the curve（AUC） and complete/half metabolism time methods to analyze the difference of the utilization between the glucose and the fructose. The results showed that the rate of utilization of fructose was less than the rate of utilization of glucose， with the number of S.cerevisiae GGSF16 increasing， the metabolism rate of glucose became faster， the effect of mixed yeast strain on fructose metabolism was higher than that of glucose， the inoculation ratio of two yeast strains had no significant effect on ethanol production， the 0∶10 group had the highest total sugar fermentation efficiency and consumption of sugar fermentation efficiency. Thus， the best vaccination ratio of Saccharomyces cerevisiae GJ2008 and Saccharomyces cerevisiae GGSF16 was 0∶10.
Key words：mixed strains； fructose； glucose； area under the curve； alcohol fermentation
（學科编辑：黎 娅）