摘要：目的 制备、纯化栓钱菌质中的多糖成分，研究其单糖组成及性质。方法 通过红栓菌固体发酵马钱子药材，培养30 d后，将发酵产物栓钱菌质烘干，粉碎，经水煮、浓缩、脱色、脱蛋白、醇沉处理后得到粗多糖，苯酚-硫酸法测定其多糖含量。采用透析、Sephadex G-150凝胶柱色谱法进一步纯化，酸水解后薄层色谱分析其单糖组成。结果 栓钱菌质粗多糖含量为47.68%，得率为10.52%，经纯化后的多糖不含核酸和蛋白质，由葡萄糖和半乳糖2种单糖组成。结论 栓钱菌质多糖是由葡萄糖和半乳糖组成的灰白色粉末状杂多糖。
关键词：马钱子；红栓菌；菌质；多糖
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）10-0080-03
Abstract：Objective To prepare and purify the polysaccharides in Shuanqian fungal substance （FS）；To study its monosaccharide composition and property. Methods Strychnos nux-vomica was under a thirty-day solid fermentation through Trametes cinnabarina. Then crude polysaccharide was got after the process of drying， smashing， water boiling， condensing， decoloring， removing protein and ethanol precipitation. The content of polysaccharides in Shuanqian FS was determined by phenol-sulfuric acid method. Dialysis and gel chromatography method was used to purify the crude polysaccharide. The purified composition was analyzed by acid hydrolysis and thin layer chromatography. Results The content of crude polysaccharide was 47.68% and yield was 10.52%. It showed that polysaccharide in Shuanqian FS contained glucose and galactose， but no nucleic acid and protein. Conclusion Polysaccharide in Shuanqian FS was an offwhite powdery heteropolysaccharide， which contained glucose and galactose.
Key words：Strychnos nux-vomica；Trametes cinnabarina；fungal substance；polysaccharide
在国际上，被称为“生物反应调节物”的药用菌多糖一般指从药用真菌的子实体、菌丝体、发酵液中分离出的、由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子聚合物，是一类能够控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖，在调节免疫功能、抑制肿瘤（食管癌、胃癌）、抗衰老、调节血压和血脂、抗补体、抗氧化、降血糖等方面起着重要的作用[1-2]，因此药用菌多糖具有较高的药用价值。
既往针对红栓菌固体发酵马钱子获得的发酵产物栓钱菌质的化学成分及药理作用研究表明，马钱子经红栓菌发酵后，达发酵终点时毒性成分士的宁和马钱子碱的含量明显下降，而士的宁氮氧化物的含量升至最高值；药理实验显示发酵后马钱子毒性明显降低，但其镇痛、抗炎与免疫抑制作用与发酵前未见明显差异[3]。本试验以栓钱菌质中多糖成分为研究对象，制备、纯化其中的多糖组分，对其含量、性质及组成进行研究。
1 仪器与试药
立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KB（上海申安医疗器械厂），超净工作台403（无锡县空气净化设备厂），隔水式电热培养箱PYX-DHS（上海医疗器械七厂），202型电热恒温干燥箱（上海索普仪器有限公司），高速万能粉碎机（河北黄骅齐家务科学仪器厂），KQ-500 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），电子天平AE240（METTLER公司），UV 2401紫外分光光度计（日本岛津公司），Nicolet IR100（美国尼高力公司）。
马钱子药材购自南京市药业股份公司，经南京中医药大学潘扬研究员鉴定为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟种子。粉碎，过10目筛。供试菌种红栓菌Trametes cinnabarina （Jacq.） Fr.由南京中医药大学生物制药教研室分离、鉴定、传代并保藏。Sephadex G-150（Pharmacia，上海化学试剂厂进口分装）；正丁醇、三氯甲烷、丙酮、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、醋酸、甲醇等均为分析纯，D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-木糖、葡萄糖等均为化学纯。
2 方法与结果
2.1 菌种培养方法
2.1.1 培养基 斜面培养基（1 L）：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂18～20 g。基础培养基（1 L）：葡萄糖20 g，蚕蛹粉10 g，KH2PO4 1.5 g，MgSO4 0.75 g， CaCO3 1.25 g，维生素B1 10 mg，初始pH值自然。
2.1.2 斜面菌种的活化 无菌条件下将红栓菌接种于斜面培养基上，27～28 ℃培养箱中避光培养4～5 d，置4 ℃冰箱保存，备用。
2.1.3 液体菌种的制备 将活化好的斜面菌种接入液体基础培养基中，置27～28 ℃摇床140～160 r/min培养4～5 d，即得。
2.2 栓钱菌质的制备
无菌条件下在马钱子基质中接入红栓菌液体菌种，（28±1）℃培养箱中培养30 d，取出，60 ℃烘干，粉碎，过60目筛。
2.3 栓钱菌质粗多糖的制备
称取栓钱菌质粉末300 g，加10倍量水煎煮2 h，趁热过滤，药渣加8倍量水煎煮1 h，滤过，合并2次滤液，浓缩至一定体积，加入30%H2O2使H2O2浓度达10%， 50 ℃恒温水浴中脱色4 h。溶液按Sevage法脱蛋白3次，即在溶液中加入0.2倍三氯甲烷和0.04倍正丁醇溶液，振荡10 min，离心，收集上清液。上清液中加入4倍体积的95%乙醇，于4 ℃冰箱内静置24 h，离心，沉淀经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥，即得菌质粗多糖FSP-1，计算得率为10.52%。
2.4 菌质粗多糖FSP-1含量测定
2.4.1 标准曲线的制备 准确称取恒重葡萄糖10 mg，定容至100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀至完全溶解。分别从中吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置具塞刻度试管中，用蒸馏水稀释至2 mL，混匀，加入6%苯酚溶液1 mL，混匀后加入浓硫酸5 mL，摇匀后置沸水浴中加热15 min，再于冷水中放置20 min，冷却至室温。以0 mL试管为空白对照，于490 nm波长处测定吸光度。
2.4.2 样品含量测定 精密称取菌质粗多糖FSP-1 24.97 mg，加适量水超声溶解，并定容至50 mL容量瓶中，制得浓度为0.499 4 mg/mL的粗多糖水溶液。分别从中吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按标准曲线操作，于490 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线方程Y=8.2X-0.018 7，r=0.998 3（n=6）。计算菌质粗多糖FSP-1中平均糖含量为47.68%。
2.5 菌质粗多糖的纯化
称取一定量菌质粗多糖FSP-1粉末，加水溶解成浓度为0.5 mg/mL的溶液。透析48 h后，溶液适当浓缩，反复醇沉，得菌质粗多糖FSP-2。取菌质粗多糖FSP-2，经Sephadex G-150柱层析（2.5 cm×50 cm），洗脱液为0.05 mol/L的NaCl，流速10 mL/h，每管收集3 mL，苯酚-硫酸法跟踪检测，收集含糖部位，得菌质多糖FSP-3。该多糖为灰白色粉末，不溶于高浓度乙醇、正丁醇及丙酮等有机溶剂，较难溶于冷水，易溶于热水。
2.6 菌质多糖FSP-3性质的测定
在试管中分别加入浓度为0.25 mg/mL的菌质多糖FSP-3水溶液1 mL，进行以下试验：①Molish反应。加入2滴Molish试剂，摇匀，最后沿管壁缓缓加入浓硫酸1 mL，静置，观察试管内两层液面交界处的反应。结果反应呈阳性，在浓硫酸与糖溶液交界面出现紫色的环，证明存在糖类物质。②茚三酮反应。加入茚三酮试剂，观察颜色变化。结果反应呈阴性，表明不含蛋白质。③碘-碘化钾反应。加入碘-碘化钾试液，观察颜色变化。结果反应呈阴性，表明不含淀粉。④三氯化铁反应。加入三氯化铁试液，观察颜色变化。结果反应呈阴性，表明不含多酚类物质。
2.7 菌质多糖FSP-3的光谱分析
2.7.1 紫外光谱 将多糖配制成浓度为0.05 mg/mL的水溶液，使用紫外分光光度计在波长190～800 nm区间进行紫外扫描，光谱图见图1。结果未见核酸 （260 nm）和蛋白质（280 nm）处的特征吸收峰，表明该多糖不含核酸和蛋白质。
2.7.2 红外光谱 取1 mg多糖样品与100 mg KBr混合，研匀后压片，用红外光谱仪在4000～400 cm-1区间扫描，光谱图见图2。可见该菌质多糖具有典型的多糖特征吸收峰（3400、2926、1637、1420、1151、656、605 cm-1）。其中，3400 cm-1出现的吸收峰主要是由多糖的配糖体羟基（缔合）伸缩振动引起的；2926 cm-1处的吸收峰与碳氢键的伸缩振动相对应；1637 cm-1为酰胺羰基特征吸收峰；1420 cm-1处的吸收峰是由酰胺基团中的C-N键伸展振动和弯曲振动引起；1250～950 cm-1之间存在吸收峰，提示糖链构型为吡喃型，是其糖苷键C-O-C的非对称振动峰；890 cm-1处无明显吸收，表明分子中不存在β-糖苷键；谱图中未出现810 cm-1和870 cm-1的峰，表示不存在甘露糖。
2.8 菌质多糖FSP-3组成分析
2.8.1 酸水解 多糖用1 mol/L H2SO4封管，100 ℃水解8 h，Ba（OH）2中和，过滤，得上清液，待用。
2.8.2 薄层色谱 用硅胶G板对水解液进行点样分析，展开剂为乙酸乙酯-醋酸-甲醇-水（12∶3∶3∶2），以葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖等标准单糖作对照，显色剂为苯胺-邻苯二甲酸。结果显示，在与对照品葡萄糖和半乳糖色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而在与对照品甘露糖、木糖、鼠李糖色谱相应的位置上，未见相同颜色的斑点。表明菌质多糖FSP-3由葡萄糖和半乳糖组成，与马钱子多糖水解液中的单糖组成一致。
3 讨论
本试验采用新型固体发酵技术，在严密可控的条件下，将红栓菌接种于马钱子基质上，培养30 d后获得发酵产物栓钱菌质。从栓钱菌质中提取得到粗多糖，其得率为10.52%。通过多糖提取工艺的优化研究有望进一步提高其得率。粗多糖经分离纯化后，得到一灰白色粉末状的多糖，是一种由葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖，糖含量为47.68%。
本试验采用常用的水提醇沉法提取得到栓钱菌质多糖，方法可行，同时采用苯酚-硫酸法进行多糖含量测定，方法简单、快速、灵敏，稳定性好。多糖易吸湿，制备多糖后应立即放入真空干燥器中，以获得疏松的灰白色粉末状多糖纯品。
目前多针对红栓菌子实体或菌丝体胞外多糖性质及其药理作用进行探讨，如红栓菌粗多糖对小鼠S180肉瘤有抑制作用，能明显提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬指数与吞噬率、外周血淋巴细胞转化率及血清溶血素水平，并能提高血清中肿瘤坏死因子-α含量[4]；从深层发酵的红栓菌菌丝体中提取的多糖能明显增加小鼠免疫器官胸腺和脾脏的质量，提高巨噬细胞的吞噬活力，促进T细胞体外增殖及接触性皮炎反应，提高小鼠血清凝集素滴度；此外，红栓菌多糖还能够增强造血系统（主要为粒细胞系统）功能和升高外周血细胞[5]，抑制肿瘤生长，提高机体免疫能力，具有延长生命的作用。而红栓菌与中药共同发酵获得的栓钱菌质中的多糖研究目前尚未见报道。本试验对栓钱菌质多糖的含量、性质、单糖组成等方面进行了初步研究。至于多糖成分与栓钱菌质本身持效减毒的物质基础是否存在一定的关联，有待对多糖活性进行进一步研究。
参考文献：
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[2] 陈福禄，谢宝贵，郑金贵.药用菌多糖的药用功能与展望[J].中国药学杂志，2005，40（4）：244-248.
[3] 刘学湘.药用真菌发酵马钱子的的持效减毒机理研究[D].南京：南京中医药大学，2010.
[4] 王俊英，刘海燕，张艳英，等.红栓菌粗多糖抗肿瘤及对荷瘤小鼠免疫功能影响的研究[J].社区医学杂志，2006，4（6）：4-7.
[5] 陈俊威，徐旭东.红栓菌多糖对环磷酰胺和60Co-γ射线所致小白鼠和犬造血系统抑制的影响[J].广东药学院学报，2005，21（5）：591-593.
（收稿日期：2014-03-23；编辑：陈静）