摘 要：目的：从肌细胞线粒体损伤的角度，探讨针刺抗运动性疲劳的效应与机制。方法：将30只SD大鼠分为针灸组、空白组和运动疲劳组，针刺组取足三里、阳陵泉、内关和肾俞穴，每日一次，留针20 min。待针刺组针灸治疗1 h后，运动疲劳组和针灸组大鼠均进行中等运动强度的水平跑台运动，连续14 d后取材，在电镜下观察肌细胞线粒体形态、检测骨骼肌MDA含量和SOD活性、测试肌细胞线粒体钙离子含量和膜电位。结果：与运动疲劳组相比，针刺组骨骼肌线粒体形态更趋于正常，其MDA含量低、SOD活性高，且能提高线粒体膜电位和钙离子含量。结论：针刺能有效的减轻运动性疲劳状态下骨骼肌线粒体的损伤，改善线粒体功能紊乱的情况，以解除活性氧自由基的毒性，提高运动机能。
关键词：运动性疲劳；骨骼肌；线粒体；氧毒性；大鼠
中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1007-3612(2011)10-0059-03
Abstract:Objective: To observe the effects and mechanism of acupuncture on the structure of rat skeletal muscle with exerciseinduced fatigue.Method: Thirty SD rats were divided into acupuncture group，control group and model group.Acupuncture group were treated Zusanli and Yanglingquan，Neiguan，Shenshu points once a day，retained the needle for 20 minutes.One hour later，the rats in the model group and acupuncture group received mediumintensity treadmill running to induce exerciseinduced fatigue.The training lasts for 14 days.The muscle fibers，mitochondria and nucleus of damage were observed under the electron microscope，and MDA content，SOD activity，mitochondria membrane potential and calcium ion content of rat skeletal muscle were measured.Result: Compared with the model group，acupuncture could reduce the damage of the skeletal muscle and its mitochondria and nucleus，and could decrease MDA of skeletal muscle cells，activate SOD activity，and help solve the problems of steady imbalance of Ca2+ and reduction of mitochondria membrane potential in skeletal muscle cells.Conclusion: Acupuncture group could gain effects of antifatigue by alleviating damage of the skeletal muscle and improved exercise ability.
Key words: exerciseinduced fatigue；skeletal muscle；mitochondria；oxygen toricity；rat
运动性疲劳的防治一直是运动医学界研究的热点，线粒体是细胞内生物氧化、三羧酸循环和氧化磷酸化的主要场所。急性或长时间运动后，线粒体内会产生大量的自由基、过氧化物，甚者线粒体内Ca2+的大量积聚，超出其缓冲能力，可引起线粒体结构损伤、功能下降，抑制线粒体氧化磷酸化，造成ATP 供给障碍等［1］。Siesjo等［2］研究认为，线粒体是细胞损伤（包括神经细胞损伤）以及影响其转归的关键细胞器，也是细胞保护机制的核心关键。补充能源物质、清除体内代谢产物或使用强壮剂是目前预防和缓解运动疲劳的主要方式。但是，这些生物制品或化学药物在起效的同时会在体内留下垃圾，甚至产生一定的毒副作用。针灸作为一种传统、安全的疗法用于缓解运动疲劳有着独特的优势。
目前针灸在防治运动性疲劳方面的研究才刚刚起步，研究尚停留在效应水平，有待于深入探讨。因此，本课题在运动性疲劳动物模型（大鼠）复制的基础上，采取补气助阳的方法，取足三里、阳陵泉、内关、肾俞等穴位对动物模型进行针灸治疗，从骨骼肌线粒体损伤的角度，探讨针灸预防与治疗运动性疲劳的效益。
1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠（动物等级：SPF；使用许可证号：SYXK（粤）2008-0085，质量合格证明编号：0031686），体重180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供物。于广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室内进行实验，常规分笼喂养，国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由进食和饮水（蒸馏水），室内相对湿度40%～55%，温度21～24℃，室内空气流通，光照时间为l2 h。
1.2 主要药品、试剂与仪器 丙二醛（MDA）含量测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定试剂盒、钙离子（Ca2+）浓度测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提。ZH-PT动物实验跑台生产厂家为淮北正华生物仪器设备有限公司，420型FACS流式细胞仪生产厂家为美国BD公司。
1.3 运动疲劳模型的建立 将30只大鼠分为针灸组、空白组和运动疲劳组，针灸组按《实用动物针灸手册》标准取足三里、阳陵泉、内关和肾俞穴，每日一次，留针20 min。待针灸组针灸治疗1 h后，运动疲劳组和针灸组大鼠均进行中等运动强度的水平跑台运动，速度为15 m/min，坡度0°，跑台20 min，间歇40 min，再跑台20 min，连续14 d。
取穴原则：足三里为足阳明胃经合穴和胃之下合穴，为补虚要穴，能促进或增强机体的免疫功能。中医认为，“肝主筋”、“主运动”，阳陵泉又称为“筋会”，针刺阳陵泉，能促使神经兴奋，促进血管扩张，血液充盈，利于组织内的水肿吸收。肾俞可平衡阴阳 ,益精补肾。内关穴是手厥阴心包经的络穴，通过针刺内关穴,可以调节机体的脏腑、气血的阴阳平衡能力和新陈代谢，保护脏腑激活机能，协调与激发神经系统，改善心血管系统机能［3］。
1.4 检测方法
1.4.1 骨骼肌的处理 于每只大鼠左后肢相同部位取2块腓肠肌为骨骼肌材料，约6 g，用4℃生理盐水清洗骨骼肌，滤纸吸干，立即放入清洁干燥密闭小瓶中，-20℃保存备用。
1.4.2 骨骼肌电镜标本的备制及观察 取上述冻存的腓肠肌1块，大小为l mm×1 mm×3 mm，立即投入25 g/L的戊二醛磷酸缓冲液固定，常规10 g/L的锇酸4℃ 后固定、丙酮梯度脱水、环氧树酯815包埋后，制作为超薄切片，醋酸铀及硝酸铅染色。在电镜下观察骨骼肌纵切面骨骼肌细胞肌纤维、肌细胞线粒体、肌细胞核等超微结构的变化。
1.4.3 MDA含量和SOD活性测定 取上述冻存的腓肠肌组织50 mg左右，加适量生理盐水，于冰水中用电动匀浆机制备成10 g/L骨骼肌细胞匀浆。骨骼肌MDA采用硫代巴比妥酸法，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法，均严格按试剂盒使用说明进行操作。
1.4.4 线粒体游离钙离子含量测定 取上述冻存的腓肠肌0.5 g左右，用眼科剪剪碎后，放入加有生理盐水的10 mL玻璃匀浆器内，冰水浴中机器匀浆器研磨成100 g/L组织匀浆液。取上述组织匀浆液，4℃环境1 000 转/min离心10 min，取上清液，4℃环境10 000 转/min离心15 min，取沉淀物，于冰水浴中用匀浆机制备线粒体匀浆液备用。采用甲基百里香酚蓝（MTB）比色法，按钙离子测定盒使用说明书进操作。
1.4.5 线粒体细胞膜电位测定［3］ 取上述冻存的腓肠肌50 mg左右，PBS液冲洗，制备成骨骼肌单细胞悬液，使用300目尼龙网过滤，将细胞浓度调样为1×106/mL，使用400目尼龙膜过滤以除去细胞团块。取上述肌细胞悬液加入等体积的Rhodamine 123，使其最终浓度为25 μmol/L，37℃避光孵育30 min，PBS洗2次，1 000 转/min离心10 min，用流式细胞仪（flow cytometry，FCM）对膜电位的检测在2 h内完成，488 nm激光激发，发射波长为534 nm，每份样本获取10 6个细胞，Cell Quest软件分析。
1.5 统计方法 采用SPSS15.0软件进行统计学分析。采用单因素方差分析，组间均值比较采用SNK法，方差不齐时组间均值两两比较采用Dunnett T3法。
2 结 果
2.1 骨骼肌线粒体形态学的影响 由图1可知，与空白组相比，运动疲劳组和针刺组大鼠骨骼肌线粒体均有不同程度的损伤，表现为：运动疲劳组线粒体结构与周围组织分界不清，基膜缺损，线粒体数较少，且大部分线粒体基质电子密度明显降低，线粒体空泡样变，嵴消失明显，嵴上颗粒消失，残存嵴平行排列结构消失；针刺组病变相对较轻，线粒体结构与周围组织分界可见，基膜基本完整，线粒体数较运动疲劳组多，大部分线粒体可见电子密度升高，结构完整的嵴和无结构的嵴同时存在。
图1 各组骨骼肌线粒体超微结构比较(×30K)2.2 骨骼肌MDA含量和SOD活性的影响 如表1所示，与运动疲劳组比较，空白组和针刺组骨骼肌MDA含量均有显著降低(均有P<0.01)；与空白组比较，针刺组骨骼肌MDA含量无显著性差异(P>0.05)。与运动疲劳组比较，空白组和针刺组骨骼肌SOD活性匀有显著性升高(P<0.01)；与空白组比较，针刺组组骨骼肌SOD活性无显著性差异(P>0.05)。
2.3 骨骼肌细胞线粒体膜电位和游离钙含量的影响 由表2可知，与运动疲劳组比较，空白组和针刺组骨骼肌线粒体线粒体游离Ca2+含量匀有显著性升高(P<0.05)；与空白组比较，针刺组骨骼肌线粒体线粒体游离Ca2+含量有显著性降低(P<0.05)。与运动疲劳组比较，空白组和针刺组骨骼肌线粒体膜电位匀有显著性升高(P<0.01)；与空白组比较，针刺组骨骼肌线粒体膜电位无显著性差异(P>0.05)。
3 讨 论
高强度训练可导致骨骼肌细胞坏死丢失。运动致骨骼肌损伤的机制是多因素的，目前的研究并未完全阐明这些机制［4-7］。线粒体是机体能量代谢的主要场所，线粒体结构的完整性是能量代谢顺利进行的保障。线粒体嵴的内表面附着有许多有柄的小球，这里有电子传递和氧化磷酸化的酶系统，它们按一定的顺序排列在膜上。以保证生物氧化反应有条不紊地在膜上进行，嵴的增多意味着能够固着生物氧化的酶系统表面积增大。
实验中的电镜图片显示：空白组的骨骼肌线粒体外膜完整，基质均匀，嵴为长条状，与线粒体长轴垂直而且骨骼肌肌丝排列整齐，肌节结构完整。运动疲劳组线粒体结构与周围组织分界不清，基膜缺损，线粒体数较少，嵴嵴破坏溶解改变、消失明显，嵴上颗粒减少或消失，肌丝杂乱、溶解，无明显完整的肌节结构，充分说明了持续运动对骨骼肌线粒体的损伤作用，同时针刺组病变相对较轻，结构完整的嵴和无结构的嵴同时存在，基膜基本完整。充分说明了 针刺对骨骼肌的保护作用，针刺保护大鼠线粒体膜的稳定性的原因可能是增强线粒体SOD活性，消除了更多的自由基，减少了运动中的氧化应激 ，从而减轻了脂质过氧化；脂质过氧化作用的减弱使线粒体膜更加稳定，线粒体膜的稳定抑制了骨骼肌线粒体游离钙的聚积 ，进一步抑制脂质过氧化作用。
本实验结果表明,与运动疲劳组比较，空白组和针刺组骨骼肌MDA含量均有显著降低，与运动疲劳组比较，空白组和针刺组骨骼肌SOD活性匀有显著性升高。MDA可作为评价自由基生成及对膜脂质双分子层破坏的指标。实验结果说明运动疲劳组大鼠运动时自由基大量积累。杨英姿等实验结果表明［8］，针灸使运动员抗氧自由基能力增强，血清SOD 活性在运动后不再降低而稍有升高,。本实验结果与其相一致，进一步提示针刺可以提高运动大鼠骨骼肌线粒体抗氧化酶活性，也进而改善了线粒体的形态。传统中医观点认为，足三里、肾俞两穴位可以平衡阴阳，益精补肾。实验结果也发现针刺“肾俞”、“足三里”后机体的抗过氧化系统能力得到加强，自由基的生成速度减缓，因此自由基的积累及其危害相应减弱。提示：针刺刺激有利于机体自由基的生成与消除之间尽快达到平衡，避免较大生理危害的发生，这是针刺足三里、肾俞平衡阴阳的可能机制之一。
线粒体内膜两侧电子的不对称分布造成线粒体跨膜电位［9］。正常生理情况下,线粒体内膜通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过。在运动疲劳期,线粒体外膜对蛋白质的通透性增高，线粒体内膜的跨膜潜能降低。当线粒体膜内外的电势差减少时. 线粒体膜电位降低，可引起线粒体膜内外一系列的生化改变,最终导致细胞凋亡［10，11］，实验表明与运动疲劳组比较，空白组和针刺组骨骼肌线粒体膜电位匀有显著性升高，说明了针刺能够改善电势差，但机制上不清楚。
通常，以衡量线粒体膜表面的巯基含量指标来表明其完整性。当巯基被自由基氧化，含量下降时，线粒体膜的完整性遭到破坏，Ca2+外流，线粒体内游离Ca2+浓度急速下降。研究表明钙与肌肉疲劳密切相关。安静时膜对Ca2+通透性低,当肌膜去极至-40 mV水平，膜对Ca2+通透性增加，触发肌肉收缩［12］。肌细胞通过电压依赖性钙通道,Rvanodine受体、钙泵、Na+-Ca2+交换等机制，实现细胞内外Ca2+调节,从而维持肌细胞正常生理功能。研究也发现骨骼肌兴奋时,钠通道介导Ca2+大量内流［12，13］。剧烈运动往往引起钙超载，通过激发一系列过程，导致细胞自稳的衰退,引起肌肉损伤。针刺组Ca2+浓度因电针刺激从而加强了机体的抗过氧化能力，减少了自由基的生成与积累，使线粒体膜得到一定程度的保护，Ca2+外流被抑制而显著高于运动疲劳组。
4 小 结
本实验发现,针刺“肾俞”、“阳陵泉”、“内关”和“足三里”穴，大鼠骨骼肌线粒体电镜下的病理变化减轻，运动能力加强，疲劳延缓。针灸降低了骨骼肌MDA的含量，提高了SOD的活性，降低肌细胞线粒体膜电位，提高钙离子含量，从而达到抗疲劳的效应。这与针刺对自由基的生成、积累产生抑制，加强抗过氧化能力，保护巯基免受自由基攻击，有效抑制线粒体内游离Ca2+外流，提高线粒体氧化代谢能力有关。这也是刺激相关穴位产生平衡阴阳、益精补肾的作用机制之一。但更深入的机制探讨，需要结合线粒体呼吸链电子漏旁路机制进一步阐述。
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投稿日期：2011-07-18
基金项目：广东省中医药局建设中医药强省科研课题“运动性疲劳大鼠模型的复制与针灸防治移动性疲劳的研究”（课题编号：K0839）。
作者简介：潘华山，研究员，硕士，硕士生导师，研究方向运动医学。