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摘要：黄瓜枯萎病是一种毁灭性的土传真菌病害，其病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum），在黄瓜整个生长周期均可发生。本试验研究球毛壳菌（Chaetomium globosum）菌株ND35与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株J2组合对黄瓜苗期枯萎病的防治效果，并对生防菌处理条件下黄瓜的根系活力、防御酶活性及防御酶相关基因表达进行初步研究。结果显示，球毛壳菌 ND35处理对黄瓜枯萎病的防效为25.36%，枯草芽孢杆菌J2处理对黄瓜枯萎病的防效为54.27%，菌株ND35与菌株J2组合处理对黄瓜枯萎病防效达到70.02%。病原菌胁迫下，生防菌组合处理的黄瓜叶片CAT、SOD、POD、PAL和PPO活性明显提高，峰值分别达91.60、3 239.15、165.80、201.03、256.38 U/gFW;与上述酶活力相关的酶活基因相对表达水平峰值分别为2.94、2.39、5.01、4.49和7.96，分别达到病原菌处理下酶活基因表达量的3.27倍、6.98倍、98%、5.27倍、 2.31倍。组合处理下黄瓜根系活力、平均防御酶活性和相关酶活基因表达水平总体高于单一生防菌处理。综之，生防菌组合对黄瓜枯萎病的防治效果高于单一生防菌防治效果。该结果可为复合微生物防治黄瓜苗期枯萎病提供理论支持。
关键词：黄瓜枯萎病菌;球毛壳菌;枯草芽孢杆菌;根系活力;防御酶
中图分类号：S436.421.1+3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）07-0072-08
由于黄瓜连年种植以及病虫害积累等一系列原因，黄瓜病害有日趋加重的趋势[1]。尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）是一种严重危害黄瓜生产的毁灭性土传真菌，可导致黄瓜枯萎病，在世界范围内严重影响黄瓜生产。黄瓜枯萎病一般导致黄瓜减产15%～25%，严重时达到50%以上甚至绝产[2]。
目前，防治黄瓜枯萎病的方法主要有化学防治、农业防治以及生物防治等[3]。化学防治上，蒋荷等[4]通过使用磷酸三钠或甲醛处理黄瓜种子、段广荣等[5]通过使用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂与多菌灵、甲基硫菌灵复配在防治黄瓜枯萎病上均取得良好防效;农业防治上，丁潮洪等[6]使用黑籽南瓜做黄瓜嫁接砧木防治黄瓜枯萎病。但是，使用化学药剂处理种子可能会对种子造成永久性损伤，长期使用也会对环境造成污染;枯萎病病原菌的变异也会造成品种抗性下降;通过嫁接技术防治枯萎病会存在黄瓜品质下降、嫁接前病菌侵染发病等一系列不可控因素。而生物防治对环境友好、可改善土壤质量、对病原菌特异性强，因此是防治该病措施的重要补充。但是生物防治也有自身的局限，例如使用单一生防菌效果不稳定、抑菌谱较窄、易受环境影响等，所以对于生物防治措施的优化改良也亟待进行。
据研究，相比单一生防菌，合理的生防菌复配具有诸多优点，例如广谱抑菌性、田间作用效果持久、促生效果更加明显等[7，8]。刘苏闽等[9]将毛壳属真菌与多种生防菌复配用于防治草莓枯萎病取得良好效果，刘东岳等[10]将丛枝菌根真菌与根围促生细菌组合用来提高黄瓜枯萎病抗病性。本试验所用生防菌球毛壳菌（Chaetomium globosum）ND35是一株分离自健康毛白杨的内生优势菌株，具有廣谱拮抗性，可产生多种抗生素[11]，能够从植物相邻细胞间隙侵入或在表面形成附着胞，提高植物防御酶活性[12，13]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）分离自山东农业大学南校区枯萎病试验田，经验证对黄瓜枯萎病具有良好的促生防病作用，并且枯草芽孢杆菌是土壤以及植物微生物生态中的优势菌群，对多种果蔬作物病害具有防治作用，促生作用也十分显著，具有防病效果稳定、对环境人畜无害等一系列优点[14]。本试验将球毛壳菌ND35与枯草芽孢杆菌J2组合防治黄瓜枯萎病菌，探究组合生防菌对黄瓜枯萎病的协同防治机理，为组合生防菌的推广应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试黄瓜品种：津春4号。
生防菌与病原菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）J2、球毛壳菌（Chaetomium globosum）ND35、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum），均由本实验室分离，于PDA斜面4℃保存培养基： PDA、 PDB培养基以及LA、LB培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 盆栽条件下不同生防菌处理对黄瓜枯萎病的防病效果 本试验共设置4组处理，分别为枯草芽孢杆菌与病原菌处理（J2+FOC），球毛壳菌与病原菌处理（ND35+FOC），枯草芽孢杆菌、球毛壳菌以及病原菌处理（J2+ND35+FOC），黄瓜枯萎病病原菌处理（FOC），以清水处理为对照（CK）。每个处理3次重复，每重复5盆植株。其他管理措施相同，14 d后统计发病率。
在高17 cm、下底宽14 cm的花盆中装自然土200 g，移栽前3 d加入200 mL孢子浓度为1×107 cfu/mL黄瓜枯萎病病原菌悬浮液。枯草芽孢杆菌J2在28℃、160 r/min培养20 h后，离心重悬浮，向每株黄瓜根部浇灌OD260为1.0～1.1的菌悬液30 mL。球毛壳菌ND35的使用浓度为3×107 cfu/g，其使用方法为将该菌剂与育苗基质混匀，制成每克含有3×107 cfu球毛壳菌孢子的育苗基质，在黄瓜育苗阶段应用。
黄瓜苗期枯萎病分级标准：0级，无症状;1级，真叶、子叶黄化面积或枯萎面积不超过总面积的50%;2级，真叶、子叶黄化面积或枯萎面积超过总面积的50%;3级，叶片枯萎或枯死，仅生长点存活;4级，植株枯死。
病情指数（%）=∑（各级病株数 × 该病级值）/ （调查总株数 × 最高级值）× 100;
防病效果（%）=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数 × 100。
1.2.2 黄瓜根系活力测定 取 0.4% TTC 溶液 0.25 mL 放入 10 mL 试管中，加少许Na2S2O4（保险粉）摇匀后立即产生红色的三苯甲腙（TTF），用含25、50、100、150、200 μg的TTF标准比色系列溶液绘制标准曲线，横坐标为吸光值，纵坐标为TTF含量，标准曲线的r2=0.9991，线性关系良好。
称取不同处理的黄瓜根尖0.3 g，放于50 mL锥形瓶中，加入0.4%的TTC溶液和磷酸缓冲液（1/15 mol/L，pH = 7）各5 mL，用保鲜膜封口后在37℃条件下暗处理1 h立即加入1 mol/L硫酸2 mL振荡后静置几分钟以终止反应（同时做空白对照，先加入硫酸，再加入根样品，其他同上）。之后将根取出，吸干水分后放入研钵，加入4 mL乙酸乙酯进行研磨以提取甲腙。将研磨的液体转移至10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容，使用酶标仪在485 nm波长下测定吸光值。根据测定的吸光值求出所取样品的根系活力，根系活力计算公式如下：
定义每一小时单位质量鲜根的四氮唑还原强度为1个根系活力单位。
单位质量鲜根四氮唑还原强度/根系活力[mg/（gFW·h）]=C/（W·t）。式中，C为根据标准曲线查出的四氮唑还原量（mg）;W为根样品重量;t为反应时间（h）。
1.2.3 黄瓜防御酶活性测定 待黄瓜长到2-3片真叶后进行移栽处理，选择长势一致的植株分别于1、3、5、7、9、11、13 d采集各处理黄瓜叶片3～5 g，分装于锡箔纸中液氮速冻，并放入-80℃下保存，供酶活测定使用。
严格按照试剂盒说明书要求，提取黄瓜叶片组织粗酶液，使用酶活试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定PPO、PAL、POD、SOD、CAT的活性。
1.2.4 黄瓜酶活基因表达量测定 采样方法同1.2.3。总RNA的提取、纯化以及RNA的反转录严格按照试剂盒说明书进行。反应体系：cDNA 9 μL、上下游引物各0.5 μL、2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL、ddH2O 6 μL。反应条件为：95℃ 3 min;95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环;72℃ 10 min。内参基因参照文献[15]，根据引物设计原则使用Primer 5软件设计修饰。每样品重复3次，计算平均循环阈值Ct和标准差。根据2-△△Ct法分析不同处理下黄瓜叶片不同防御酶基因的相对表达量。引物序列信息参照表1。
1.3 数据分析
采用Microsoft Excel 2007作图，用SPSS 19.0统计软件对数据进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同处理对黄瓜枯萎病的盆栽防治效果
由表1可知，J2+ND35+FOC处理的植株发病率远低于FOC处理。J2+FOC处理和ND35+FOC处理防病效果分别为54.27%和25.36%，J2+ND35+FOC处理防病效果达70.02%。
2.2 不同生防菌处理对黄瓜植株根系活力的影响
由图1可知，黄瓜苗的根系活力在1～3 d略有上升，3～5 d迅速下降，随后趋于平稳。其中J2+ND35+FOC处理3～7 d的根系活力明显高于其它处理，第5 d与FOC处理差异最大，第7 d与J2+FOC、ND35+FOC处理差异最大。空白CK的平均根系活力高于FOC处理，但低于生防菌处理下的根系活力。由此可知，枯草芽孢杆菌J2与球毛壳菌ND35能够减缓根系活力的下降，其根系活力高于对照，并且生防菌组合处理的根系活力明显高于其它处理。
2.3 不同处理黄瓜防御酶活性变化
由图2A看出，J2+ND35+FOC、ND35+FOC和J2+FOC处理的CAT均在第3、7、11 d出现活性峰，其中以第3 d的峰值最高，FOC处理在第3 d达到活性高峰后迅速降低，随后一直保持在比较低的水平。相比FOC处理，J2+ND35+FOC处理在第3 d与其差异最大，CAT酶活性提高34.13%，相比J2+FOC和ND35+FOC处理，CAT酶活性提高16.55%和9.03%。CK处理酶活性一直保持在较低水平且无明显变化。
由图2B可知，不同处理的SOD活性水平具有明显差别，且活性峰值出现的时间不同，其中J2+ND35+FOC处理在第5 d和第11 d出现活性峰，并且总体SOD活性高于J2+FOC、ND35+FOC处理以及FOC处理，处理第5 d时高于FOC处理 33.71%。CK的SOD活性变化不大，但总体高于FOC处理。
由图2C可知， J2+FOC和J2+ND35+FOC处理的POD活性迅速上升，J2+FOC处理在第5 d达到峰值，J2+ND35+FOC处理在第13 d达到活性峰值，但是低于J2+FOC处理第5 d的活性。ND35+FOC处理在第3 d和第11 d形成活性峰，FOC处理在第3 d时POD活性迅速升高随后回落到CK水平，CK的酶活变化不大。在所有处理中，J2+ND35+FOC的POD平均酶活力最高，第13 d时高于FOC处理12.43%。
由圖2D可知，各处理PAL活性在第3 d时形成第一个活性峰。J2+ND35+FOC处理在3～7 d保持较高的PAL活性水平，FOC处理在第5 d和第9 d形成活性峰，且平均酶活性水平略高于CK。J2+ND35+FOC与FOC处理第7 d酶活性差别最大，高于FOC处理10.46%。
图2E可知，各处理的PPO活性在前期迅速上升然后随时间成波动变化趋势。J2+ND35+FOC处理的平均PPO活性最大，第3 d达到最高值，酶活性分别比FOC、J2+FOC、ND35+FOC处理提高43.35%、39.87%和24.62%，FOC处理在前期平均酶活高于空白对照，但9 d后降低至CK之下。
2.4 不同处理黄瓜防御酶基因表达水平变化
由图3A可知，除CK外，其它各处理的CAT基因表达在3 d之前均极速上升，然后下降并趋于平稳。CK的CAT基因表达差异不大，J2+ND35+FOC处理在整个时期都呈现出较高的表达水平，第3 d时相比FOC处理提高了2.27倍。
由图3B可知，J2+ND35+FOC处理的SOD相对表达量在第5 d和第9 d达到峰值，总体表达水平高于其它处理，其中第9 d时的转录水平与其他处理差异最大，相比FOC处理表达水平提高了6倍;J2+FOC处理5 d后转录水平一直较高;CK一直保持相对平稳且较低的表达水平。
由图3C可知， J2+ND35+FOC处理的POD相对表达量在1～5 d上升后下降，到11 d时趋于平稳，总体表达量相较于J2+FOC处理和ND35+FOC略有减少。J2+FOC处理在第5 d时达到峰值，ND35+FOC处理在第3 d和第11 d形成峰值。
由图3D可知，J2+ND35+FOC及J2+FOC处理1～5 d间PAL表达水平迅速提高，之后缓慢下降直至趋于平稳，ND35+FOC处理在7 d时达到峰值。相比FOC处理，J2+ND35+FOC處理在第5 d与其差异最大，表达水平是其5.27倍。
由图3E可知，J2+ND35+FOC及J2+FOC、ND35+FOC处理的PPO表达量在1～3 d迅速升高。相较于FOC处理，J2+ND35+FOC处理在第7 d与其差异最大，表达水平是其15.93倍。
3 讨论与结论
研究发现，生防菌复配防病并不是简单的累加效果，而是受多种因素控制，防病效果好的生防菌组合在一起并不一定防病效果好[19，20]，因此选择合适的生防菌复配显得尤为重要。本研究通过盆栽试验发现，生防真菌ND35与生防细菌J2复合处理后防病效果显著好于单一生防菌处理，说明两生防菌株在防病机理上有一定的协同作用。
植物根系活力是植株生长是否健康的重要指标之一[21，22]。枯萎病是一种土传病害，能够从植株的根部进行侵染，进而影响植株的根系活力，损害植株健康。由本研究可知，经过生防菌处理后的植株根系活力较不做接种处理（CK）以及单一接种病原菌的处理高，生防菌组合较单一生防菌处理效果更好。因此经过生防菌组合处理后，植物根系保持了较好的活力水平，进而保持根系对地上部营养物质的高效运输，使整个植株保持比较健康的水平以增强对枯萎病的抗病能力。
植株在受到病原菌攻击后，会导致活性氧的过量积累或者代谢失调，进而导致植物细胞膜系统遭到破坏，影响植物的抗病免疫。SOD、CAT、POD、PPO、PAL是与植物抗病有关的防御酶。CAT、SOD和POD三种防御酶是植物体内清除活性氧相关的酶，其中SOD是ROS机制中最先被激活的酶，可以将活性氧分解为过氧化氢和氧气，紧接着CAT将SOD产生的过氧化氢分解为水和氧气;POD通过共基质的酚类抗氧化剂或化合物氧化分解过氧化氢，POD还可参与木质素的合成，其活性升高有利于细胞壁木质化从而阻止病原菌的侵入和扩展，这三种酶对于维持植物体内ROS稳态具有重要作用[23，24]。PPO可催化单元酚和邻二羟酚氧化为醌类物质，促进类似木质素物质的聚合从而抑制病原菌的生长，而且醌类物质对微生物具有高毒性;PAL 可调控酚类物质和木质素的合成[25]。
由本研究可知，黄瓜接种生防菌后几种防御酶活性相比FOC处理都有不同程度的提高，7 d后FOC处理的几种酶活性都逐渐降低甚至低于空白对照，而生防菌处理依旧保持较高水平。这说明生防菌在病原菌侵染黄瓜过程中激发了黄瓜更高、更持久的抗病能力，而组合处理较单一生防菌处理的POD、SOD、CAT以及PAL的平均酶活性要高，PPO活性略低于单一生防菌处理，说明组合处理在黄瓜抗病过程中发挥了一定的协同作用。孙润红等[26]将枯草芽孢杆菌接种于小麦后发现，PAL、POD、SOD、CAT以及PPO等防御酶活性有不同程度的提高，与本研究结果基本一致。从对相关几种防御酶活基因表达分析来看，随着时间的增加，除了空白对照，其他各处理5种酶活基因表达水平总体呈现一个先上升后降低的趋势，且组合生防菌处理的酶活基因表达水平较高，与酶活性的变化大体一致，说明生防菌处理下黄瓜抗病能力的上升主要通过增加防御酶基因表达水平进而提高相应的防御酶活性来实现的。但是由于酶活性大小由多个基因控制，以及转录后调控等因素的影响，酶活性的变化与相关基因的表达并不完全一致。J2+ND35+FOC处理下POD基因表达水平低于单一生防菌处理，但平均POD活性高于单一生防菌处理;各处理的PPO活性在上升后基本保持平稳，但是生防菌处理后的PPO基因表达水平很高。
由于不同生防菌、不同病害作用方式不同，生防菌之间的作用机理也十分复杂，生防菌组合涉及到一系列复杂的反应，因此对于生防菌之间的互作还有待进一步探究;大田条件下生防菌组合的使用、接种时间、剂型等都会影响到实际效果，因此对于生防菌组合在田间的推广也有待进一步研究。
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