摘要： 毛状根的构型是影响其生长速度和生物量积累的重要因素，为了规模化培养金铁锁毛状根，进一步解决金铁锁资源短缺问题，该研究以金铁锁毛状根为材料，通过改变培养基类型、碳源及碳源浓度，观察和分析了毛状根的生长状态，找出影响毛状根构型的因素。结果表明：最适合金铁锁毛状根生长的培养基为B5+蔗糖30 g·L-1，金铁锁毛状根主根长而粗壮，一级、二级侧根生长量大，根系表面积较大，生长效果最佳。经液体悬浮培养验证，测定毛状根的生长量，与在固体培养基培养的毛状根生长状态基本一致。通过该项研究，优化了培养基中营养成分的配比，实现了金铁锁毛状根的快速生长和生物量的积累。
关键词： 金铁锁， 毛状根， 培养基类型， 碳源， 碳源浓度， 液体悬浮培养
中图分类号： Q943.1文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2018）07-0859-07
Abstract： The configuration of hairy roots is an important factor affecting its growth rate and biomass accumulation. In order to cultivate the hairy root of Psammosilene tunicoides in a large scale and to solve the problem of its resource shortage， hairy roots of Psammosilene tunicoides were sampled for exploring the effects of medium types， carbon source and carbon concentration on the growth of hairy roots. The results showed that the most suitable medium for growth of hairy roots was B5 + 30 g·L-1 sucrose. Hairy roots are long， thick and strong， with large amount of the first and the second lateral roots and larger root surface area. Further examination was carried out in the mode of liquid suspension culture， and gained the similar conclusion with that of solid culture mode for the index of biomass of hairy roots. In this study， optimization of factors in the culture media facilitated the rapid growth and biomass accumulation of hairy roots.
Key words： Psammosilene tunicoides， hairy roots， medium types， carbon source， carbon source concentration， liquid suspension culture
金铁锁（Psammosilene tunicoides）是石竹科金铁锁属单种属植物，主要分布于我国西南地区（赵爽等，2012）。金铁锁的干燥根能祛风除湿、散瘀止痛、解毒消肿，是我国中成药保密品种“云南白药”的重要成分之一，为《中国植物红皮书》中的国家二级重点保护的珍稀濒危物种（李景滨等，2011）。金铁锁的主要化学成分是三萜类皂苷、环肽以及内酰胺等（金虹和谭克勤，2005）。由于金铁锁野生资源破坏严重，且医药临床需要急剧增加，利用毛状根培养技术（Zhang et al，2014）定向培养，是获取金铁锁天然活性产物的一种有效手段。毛状根，又称发状根、发根，是将发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）中Ri质粒含有的T-DNA整合到植物细胞的DNA上，产生的一种病理现象（陈岺曦和王伯初，2007）。体外培养中，毛状根具有生长速率快、高度分叉、激素自养等特点，是生产次级代谢产物非常理想的培养物（韩昱姝等，2014）。
毛状根生长速度与其空间构型（侧根分布）、营养供给、培养技术等因素有关。目前有关毛状根空间构型建成机理的研究文献相对较少，对于根构型建成的结果主要来自拟南芥、玉米、小麦、番茄、胡萝卜、洋葱、豆类等普通植物根系发育模型的研究。侧根分布和向地性生长是决定根构型的主要因素，由参与调节根生长方向、动力学、根毛、侧根频率等参数的环境信号及其它信息决定的。其中侧根是决定根构型的最关键因素之一。侧根的发生首先在主根的中柱鞘细胞启动，细胞经过分裂、分化形成侧根原基，然后继续发育并突破表皮形成侧根（王树才等，2003）。研究表明，养分对侧根构型具有一定的影响。植物能感受生长介质中N、Pi、S和Fe等养分的有效性并形成可识别的信号，从而调节植物細胞分裂和分化，影响根毛形成、主根生长和侧根发育（López-Bucio et al，2002，2003）。本研究通过改变培养基类型、碳源及碳源浓度，观察金铁锁毛状根的生长状态，测定毛状根的生物量，从而优化培养条件，建成毛状根空间构型，为金铁锁毛状根规模化生产奠定基础，进一步解决金铁锁资源短缺问题。
1材料与方法
1.1 材料
金铁锁毛状根，来自大连工业大学珍稀濒危药用植物细胞工程实验室。
1.2 方法
1.2.1 培养基类型的筛选从优良株系中剪取毛状根根尖分别接种于5种直径90 mm的平板培养基中，内装MS、1/2 MS、1/2 B5、B5、N6固体培养基，pH6.0，每个平板中接入毛状根鲜重为0.3 g，每种培养基3个平行样，25 ℃下暗培养。观察毛状根在培养5、15、28 d后生长状态及构型。
1.2.2 碳源的筛选以B5固体培养基为基础培养基，分别添加同量的蔗糖、乳糖和葡萄糖，作为毛状根生长的碳源，从优良株系中剪取毛状根根尖分别接种于3种直径90 mm的平板培养基中，其他培养条件同1.2.1。观察毛状根在培养5、15、28 d后生长状态及构型。
1.2.3 碳源浓度的筛选以B5固体培养基为基础培养基，以蔗糖作为毛状根生长的碳源，从优良株系中剪取毛状根根尖分别接种于6种直径90 mm的平板培养基中，内装碳源浓度分别为0、20、30、40、60、80 g·L-1，其他培养条件同1.2.1。观察毛状根在培养5、15、28 d后生长状态及构型，同时测定毛状根主根直径与侧根间距。
1.2.4 金铁锁毛状根的构型如图1所示，金铁锁毛状根呈现多级化，主根粗壮，直径大，根系较长；一级侧根分枝角度40°～70°之间，根系在更大范围内扩展且密度较大；二级根较短但密度大，根系表面积大，从而间接地反映了根系的生物量较大。
1.2.5 液体悬浮培养营养条件优化从优良株系中剪取毛状根根尖分别接种于5种250 mL的锥形瓶培养基中，内装MS、1/2 MS、1/2 B5、B5、N6液体培养基100 mL，pH6.0，每个瓶中接入毛状根鲜重为0.5 g，每种培养基3个平行样，25 ℃下暗培养，摇床转数110 r·min-1。培养18 d后，观察毛状根生长状态及构型，测定毛状根生物量。
以B5液体培养基为基础培养基，分别添加同量的蔗糖、乳糖和葡萄糖三种糖，作为毛状根生长的碳源，从优良株系中剪取毛状根根尖分别接种于3种250 mL的锥形瓶培养基中，pH6.0，每个锥形瓶中接入毛状根鲜重为0.5 g，每种培养基3个平行样，25 ℃下暗培养，摇床转数110 r·min-1。培养18 d后，观察毛状根生长状态及构型，测定毛状根生物量。
以B5液体培养基为基础培养基，以蔗糖作为毛状根生长的碳源，从优良株系中剪取毛状根根尖分别接种于6种250 mL的锥形瓶培养基中，内装碳源浓度分别为0、20、30、40、60、80 g·L-1，pH6.0，每个锥形瓶中接入毛状根鲜重为0.5 g，每种培养基3个平行样，25 ℃下暗培养，摇床转数110 r·min-1。培养18 d后，观察毛状根生长状态及构型，测定毛状根生物量。
1.2.6 金铁锁毛状根增长率的计算将液体悬浮培养18 d的毛状根冷冻干燥，经万分之一电子天平称量干重，计算毛状根增长率。计算公式：
增长率 = （收获干重-接种干重） /接种干重。
2结果与分析
2.1 培养基类型对毛状根构型的影响
由图2可知，MS、1/2 MS、1/2 B5、B5、N6 5种固体培养基对金铁锁毛状根构型的影响。毛状根在各固体培养基中整体向四周延伸生长，但根系长度、直径、疏密等存在较大差异。B5培养基中的毛状根生长速度最快，主根粗壮，直径较大，一级、二级侧根多而长，根系表面积较大，几乎铺满整个平板。1/2 B5培养基中的毛状根生长状态次之，根的绒毛多，但主根相对较细。MS和1/2 MS培养基中的毛状根生长状态基本相近，主根少而短，一级、二级侧根比较稀疏，根系表面积相对较小。N6培养基中的毛状根生长缓慢，主根、一级、二级侧根均较少，整体呈现老化态势。
2.2 碳源对毛状根构型的影响
由图3可知，分别添加30 g·L-1的蔗糖、乳糖和葡萄糖的B5固体培养基对金铁锁毛状根构型的影响。在25 ℃条件下培养28 d后，添加蔗糖的培养基中毛状根主根长而粗壮，一级侧根密集且表面有大量绒毛，进一步发育成二级侧根，根系表面积大。添加乳糖的培养基中毛状根主根少且短，一级侧根极少，基本不生长。添加葡萄糖的培养基中毛状根主根稀疏，侧根较短且呈现畸态。
2.3 蔗糖浓度对毛状根的构型影响
由图4和表1可知，在25 ℃条件下培养28 d后，蔗糖浓度为0 g·L-1时，毛状根基本不生长，仅有少量主根，直径仅为（0.322 2±0.009 4）mm，一级侧根较为稀疏，侧根间距为（5.485 9±0.361 4）mm。随着蔗糖浓度的增大，毛状根主根发达，一级、二级侧根密集，当蔗糖浓度为30 g·L-1时，毛状根生长状态最佳，主根直径达到（0.763 6±0.010 4）mm，侧根间距为（2.105 1±0.236 6）mm，根系表面积达到最大。随着蔗糖浓度继续增大，毛状根主根开始减少且长度变短，一级、二级侧根也相对减少。蔗糖浓度达到80 g·L-1时，主根直径为（0.539 6±0.006 1）mm，侧根间距为（2.105 1±0.236 6）mm，生长受到抑制。
2.4 液体悬浮培养营养条件对毛状根的构型影响
从图5可以看出，经液体悬浮培养18 d，B5培养基中的毛状根主根粗壮且生长出大量一级、二级侧根，生长量最大，其增长率为（12.95±0.35）%。但B5培养基中毛状根由于生长速度较快，培养时间过长，逐渐老化。N6培养基中毛状根主根较少，侧根较细，生长量最小。液体悬浮培养过程中，金铁锁毛状根对蔗糖的利用率最高， 生长量随蔗糖浓度的增加，呈先升后降的趋势。当蔗糖浓度为0 g·L-1时，毛状根生长量最小；当蔗糖浓度为30 g·L-1时，毛状根生长量最大，增长率为（13.89±0.33）%，分支多而粗壮；随着蔗糖浓度继续增大，毛状根生长量逐渐降低，毛状根生长受到抑制。
3讨论与结论
3.1 培养基的选择
本研究中，不同培养基所含营养物质的成分及比例不同，但培养基中适当的营养物质浓度对毛状根的生长具有促进作用，过低或者过高均会对其生长产生一定的限制作用。Bensaddek et al（2001）以顛茄毛状根为材料研究硝酸盐和铵盐浓度的作用，结果发现氨态氮的升高会导致毛状根生长量降低。高帅等（2012）的研究表明，毛状根在B5培养基中生长状态最好，干重增加了15.8倍，随着硝态氮含量的降低，毛状根的生长量也逐渐降低，推测硝态氮是影响毛状根生长的主要元素之一。此外，Mg2+是影响毛状根生长的另一重要元素。在研究营养元素对丹参毛状根生长的影响时发现，提高大量元素 MgSO4·7H2O含量，能促进丹参毛状根的生长（沈双等，2011）。本研究中，B5培养基中的硝态氮、MgSO4·7H2O含量均最高，氨态氮含量较低，毛状根主根粗壮，一级、二级侧根密集且长，生长能力极强，与前人的研究结果相似。刘军等（2013）的研究发现，在1/2 MS培养基上生长的毛状根各方面性质都较好，在B5培养基中生长速度快，但容易褐化，MS培养基中的毛状根也会有一定褐化，N6和1/4 MS培养基的毛状根生长速度较慢。可见，金铁锁毛状根在液体和固体培养基中培养对培养基的要求是有差异的。
3.2 碳源及碳源浓度的选择
碳源为毛状根的生长提供了物质基础，但不同的碳源对毛状根构型具有不同的影响。本研究结果表明，以蔗糖作为碳源，金铁锁毛状根，侧根较多，生物量最大；以葡萄糖、果糖作为碳源，毛状根生长速度下降，出现褐变现象；而以乳糖、麦芽糖、淀粉为碳源，毛状根分枝急剧减少，生长受到抑制。金铁锁毛状根利用蔗糖的能力最强，有利于毛状根的生长（田思迪等，2012）。在水母雪莲毛状根和南美蟛蜞菊毛状根的研究中均发现，以葡萄糖作为碳源更有利于毛状根的生长（杨睿等，2005；欧少云等，2010）。这与本研究的结果有差异，可能与实验中所用植物材料有关， 不同植物对于碳源的吸收和利用效率具有明显的不同。本研究发现，蔗糖浓度是影响毛状根构型的又一重要因素。假酸浆毛状根生长速度随着MS液体培养基中蔗糖浓度的升高，其增殖量呈现先增后降的现象（马玲等，2013）。宁凝和杨世海（2013）在研究培养因子对黄秋葵毛状根生长影响时发现，蔗糖浓度为3%时，对黄秋葵毛状根的促进作用最强，增殖倍数最高。本研究中，毛状根生长量随着蔗糖浓度的增大而逐渐增大；当蔗糖浓度为30 g·L-1时，毛状根主根粗壮，直径较大，产生大量的一级、二级侧根，根系表面積较大，生长量达到最大；当蔗糖浓度继续增加时，毛状根生长受到抑制，这些结果与前人的研究结论基本一致。
总之，通过改变培养基类型、碳源及碳源浓度及优化培养条件，可以促进金铁锁毛状根的生长，实现毛状根主根长且粗壮、一级和二级侧根密集、根系表面积较大等较理想的毛状根表型，对后续的工业化生产提供了重要的基础数据。
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